Gebiedsgebaseerd beeldanalysealgoritme voor kwantificering van macrofaag-fibroblastcoculturen
15 februari 2022
We presenteren een methode, die gebruik maakt van een generaliseerbare gebiedsgebaseerde beeldanalysebenadering om celtellingen te identificeren. Analyse van verschillende celpopulaties maakte gebruik van de significante celhoogte en structuurverschillen tussen verschillende celtypen binnen een adaptief algoritme.
Deze methode kan worden gebruikt om onderzoekers te helpen bij het analyseren en tellen van co-culturen van cellen met behulp van een eenvoudige en effectieve gebiedsgebaseerde analyse. Deze techniek is relatief eenvoudig te implementeren met behulp van algemeen beschikbare software en biedt een betrouwbare en nauwkeurige manier om verschillende celtypen binnen een co-cultuuromgeving te identificeren. Deze methode kan inzicht geven in hoe specifieke co-culturen van cellen synergetisch samenwerken om te helpen bij weefselregeneratie.
Deze methode kan ook worden gebruikt om monocultuur biomarker studies te valideren. Om te beginnen kweekt u ruwe 264,7 macrofagen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide voor monocultuurbeeldvorming in één milliliter DMEM aangevuld met FBS, penicilline-streptomycine, natriumbicarbonaat en bèta-mercaptoethanol in een celkweekkolf van vijf milliliter met een dichtheid van 25.000 cellen per vierkante centimeter. Kweek NIH/3T3 cellen in DMEM aangevuld met 10%FBS en 1%penicilline-streptomycine.
Voor co-kweek beeldvorming, kweek ruwe 264.7 macrofagen en NIH / 3T3 fibroblasten met behulp van co-kweek medium met een deel ruwe 264.7 medium en een deel NIH / 3T3 medium samen in verschillende verhoudingen en totale dichtheid van 25.000 cellen per centimeter vierkant. Na het zaaien incubeer je de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om een levensvatbare celdichtheid van 80% celconfluentie te bereiken. Om celbeelden te verkrijgen met behulp van een omgekeerde microscoop die is uitgerust met het 40X-objectief, bepaalt u de capaciteit van het algoritme om afbeeldingen met een reeks beeldkwaliteiten nauwkeurig te evalueren.
Verkrijg afbeeldingen in grijstinten met verschillende foci die zowel niet-bulbus- als bulbusafbeeldingen produceren en exporteer ze in het raw czi-bestand. Als u afbeeldingen van cellen wilt verkrijgen met behulp van de gebiedsgebaseerde methode, kopieert en plakt u het afbeeldingsbestand voor analyse in de prullenbak en voert u de bestandsnaam in door de opdracht uit te voeren. Druk op Uitvoeren om het programma te starten.
Analyseer de beelden door te openen door reconstructie, gevolgd door te sluiten door reconstructie met behulp van bronfuncties om de voorgrond vanaf de achtergrond te vergroten door het betreffende commando uit te voeren. Om de gereconstrueerde afbeeldingen te binariseren met behulp van een op percentielen gebaseerd identificatiesysteem, onderscheidt u cellen van de achtergrond door een percentielverschil te gebruiken met de maximale relevante pixel met de grootste pixelwaarde die ten minste 0,5% van een bepaalde afbeelding omvat. Analyseer en evalueer de pixelwaarden voor onbewerkte 264,7-macrofagen en zorg ervoor dat de waarden zich binnen 4,5% van de maximale relevante pixel bevinden.
Markeer vervolgens de pixel als mobiel. Voor afbeeldingen die bulbuscelprofielen bevatten, implementeert u een iteratieve procedure om te corrigeren voor foutieve binarisatie in de centra van de cellen. Bepaal een eerste schatting voor de totale celdekking.
Voer het algoritme uit en analyseer afbeeldingen met behulp van de eerste schattingen van alfa en kappa om een deel van de eilanden te vullen. Gebruik vervolgens de celtellingen en dekking na de analyse om kappa opnieuw te berekenen. Om het gemiddelde celoppervlak te bepalen na binarisatie van de afbeelding, verkrijgt u een vector van alle centrale locaties en stralen van cirkels in de afbeelding door de opdracht uit te voeren.
Gebruik de radii-uitgangen om het gemiddelde celoppervlak te berekenen door ten minste 10 cellen te gemiddelden en te analyseren om een nauwkeurige gebiedsidentificatie te garanderen. Voer de afbeeldingsanalyse uit met behulp van de opdrachten zoals eerder beschreven. Voer vervolgens een analyse uit van co-culturen die ruwe 264.7- en NIH / 3T3-cellen bevatten door experimenteel een parameter phi te bepalen met behulp van afbeeldingen van onbewerkte 264.7- en NIH / 3T3-cellen.
Raad een initiële phi-waarde en herhaal totdat het aantal cellen en de dekking nauw overeenkomen met de handmatige tellingen die specifiek zijn voor de ruwe 264.7- en NIH / 3T3-co-cultuur. Bepaal ruwe 264,7 celtellingen in totale celdekking zoals eerder beschreven voor de monocultuurbeelden. Analyseer het omvormde beeld van de waterscheiding opnieuw zonder de phi-parameter en detecteer zowel macrofagen als fibroblasten.
Verkrijg NIH/3T3 fibroblastgegevens door selectief ruwe 264,7 celpixels af te trekken die zijn verkregen met behulp van de standaarddrempel- en gebiedsgebaseerde kwantificeringsmethoden die eerder zijn beschreven. Analyse van niet-bulbus ruwe 264.7 macrofagen werd uitgevoerd en algoritme-outputs werden geregistreerd. Gemiddelde gebiedsberekeningen van het beeld met behulp van algoritme telden 226 cellen, terwijl een handmatige telling 241 cellen identificeerde met een geschatte foutwaarde van 6% Analyse van bulbus ruwe 264,7 macrofagen werd ook uitgevoerd.
De gemiddelde oppervlakteberekeningen van het beeld met behulp van algoritme telden 221 cellen, geverifieerd door een handmatige telling van 252 cellen met een geschatte foutwaarde van 12% Analyse van co-culturen die zowel ruwe 264,7 macrofagen als NIH / 3T3 fibroblasten bevatten, werd uitgevoerd. Algoritme-uitgangen voor het ruwe 264,7 macrofaaggetal waren 137, terwijl een handmatige telling 155 cellen identificeerde met een geschatte foutwaarde van 11% Om de robuustheid van het celtelalgoritme te bepalen, werden vijf onbewerkte 264,7 macrofagenafbeeldingen geteld door automatische celidentificatie en handmatige gebruikerstellingen. De dobbelsteencoëfficiënt werd verkregen met een gemiddelde parameter van 0,85 over vijf afbeeldingen.
De cruciale stap binnen dit protocol is het gebruik van op percentielen gebaseerde parameters die robuuste celdetectie mogelijk maken in zowel monocultuur- als co-cultuurbeelden. Dit protocol kan worden gebruikt om cellen van belang te identificeren voor verdere analyse met behulp van moleculair biologische technieken om biomarkers te beoordelen die specifieke celpopulaties en biomarkerontwikkeling in co-cultuursystemen definiëren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het analyseren en tellen van co-culturen van cellen met behulp van een op oppervlakte gebaseerde beeldanalysebenadering. De techniek is ontworpen om eenvoudig en effectief te zijn en biedt een betrouwbare identificatie van verschillende celtypen binnen een co-cultuursetting.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Beeldanalyse
- Weefselregeneratie
Achtergrond
- Co-culturen van cellen kunnen inzicht bieden in cellulaire interacties.
- Verschillende celtypen vertonen significante structurele verschillen.
- Nauwkeurige celtelling is cruciaal voor het begrijpen van de dynamiek van co-culturen.
- Bestaande methoden kunnen tekortschieten in betrouwbaarheid of gebruiksgemak bij de implementatie.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor effectieve celtelling in co-culturen.
- Om het begrip te vergroten van hoe specifieke celtypen synergetisch samenwerken.
- Om biomakerstudies in monoculturen te valideren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van oppervlaktegebaseerde beeldanalyse voor celidentificatie.
- Kweek van raw 264.7 macrofagen en NIH/3T3 cellen.
- Implementatie van een adaptief algoritme voor analyse.
- Gebruik van algemeen beschikbare software voor een eenvoudige toepassing.
Belangrijkste resultaten
- De methode levert betrouwbare en nauwkeurige celtellingen op.
- Het maakt effectief onderscheid tussen verschillende celtypen.
- Er is inzicht verkregen in mechanismen van weefselregeneratie.
- Validatie van monocultuurstudies is gerealiseerd.
Conclusies
- De op oppervlakte gebaseerde analysemethode is een waardevol instrument voor onderzoekers.
- Het vereenvoudigt het proces van het analyseren van co-culturen.
- De techniek kan studies in de celbiologie en weefseltechnologie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Nauwkeurige kwantificering van heterogene celpopulaties is essentieel om risico's bij de validatie van targets in onderzoek naar weefselregeneratie en fibrose te beperken. Dit op oppervlakte gebaseerde beeldanalyse-algoritme maakt een betrouwbaar onderscheid en tellen van macrofaag-fibroblast-coculturen mogelijk, wat mechanistische risicoreductie ondersteunt door ambiguïteit in studies naar cellulaire interacties te verminderen. De methode biedt voorspellende zekerheid in de vroege ontdekkingsfase door kwantitatieve, reproduceerbare resultaten te leveren die essentieel zijn voor go/no-go-beslissingen bij de selectie van preklinische modellen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de bijdragen van macrofagen en fibroblasten in coculturesystemen te kwantificeren.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door middel van reproduceerbare celtellingen met een beperkte foutmarge (<10% foutmarge) in complexe co-cultureomgevingen.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door kwantitatieve gegevens te leveren over celtype-specifieke reacties op modulatoren of genetische perturbaties.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten voor de gereedheid van assays onder condities met een hoge zaadingsdichtheid.
- Operationele waarde: Garandeert de reproduceerbaarheid van de assay via percentielgebaseerde drempelwaarden en iteratieve correctie voor niet-ideale celmorfologieën.
- Schaalbaarheid: Maakt hergebruik van het platform mogelijk voor verschillende cocultuurverhoudingen en beeldkwaliteiten met behulp van algemeen beschikbare MATLAB-gebaseerde tools.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Ondersteunt ziekterelevante systeemmodellering door analyse mogelijk te maken van coculturen die centraal staan in weefselregeneratiepaden.
- Mechanische risicoreductie: Isoleert de bijdragen van fibroblasten en macrofagen via selectieve exclusie-algoritmen, waardoor padspecifieke effecten worden verduidelijkt.
- Preklinische gereedheid: Biedt gevalideerde celaantallen dieten ten goede komen bij de beoordeling van biomarkers en moleculaire analyse van specifieke populaties.
Integratie van pipeline & workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot preklinische evaluatie, en biedt een herbruikbare mogelijkheid voor het kwantificeren van stromale immuuninteracties in modellen van fibrose en wondgenezing.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door nauwkeurige fenotypering van macrofaag-fibroblast-cocultures mogelijk te maken.
- Screening: Zorgt voor assay-standaardisatie en kwantitatieve resultaten die essentieel zijn voor betrouwbare compound-screening in coculturesystemen.
- Analytics: Genereert metingen (celaantallen, dekking, oppervlakte) waarmee teams condities kunnen vergelijken en biologische responsen kunnen beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt discovery met preklinische validatie door analyse van cocultures in contexten van weefselregeneratie mogelijk te maken.
- Enterprise Reuse: Kaderstelt de methode als een schaalbaar, gestandaardiseerd instrument dat toepasbaar is op meerdere celtypen en ziekte-modellen.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door vermindering van mechanistische ambiguïteit in cocultuursystemen.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over variërende beeldkwaliteiten en celdichtheden.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een late stadium binnen fibrose- en regeneratieprogramma's.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van kwantitatieve, reproduceerbare cocultuur-fenotyperingsgegevens.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in beeldanalyse en MATLAB-programmering voor de implementatie van algoritmen en het afstellen van parameters.
- Afhankelijk van inversiemicroscopie met een 40X objectief en mogelijkheden voor grijstoonbeeldacquisitie.
- Vereist standaardisatie van beeldacquisitieprotocollen (focus, belichting, bestandsformaat) tussen teams voor consistente prestaties van het algoritme.
- Vereist aanpassing van parameters (phi, alpha, kappa) bij toepassing op verschillende celtypen of cocultuurverhoudingen.
- Praktische beperking: de nauwkeurigheid van het algoritme is afhankelijk van voldoende hoogteverschillen tussen celtypen voor een effectieve segmentatie.
