Microfluïdische Aanvragen voor eenmalig gebruik Diagnostics

Mijn naam is Catherine CloudBridge en ik ben professor in productietechnologie, engineering en biomedische technologie aan de Boston University. Daarnaast ben ik de directeur van het Biomedical Micro Devices and Microenvironments Laboratory. Wij richten ons hoofdzakelijk op het ontwikkelen van wegwerpbare diagnostica voor toepassingen in omgevingen met beperkte middelen.

Daarom gebruiken we microfluidica om deze apparaten te maken. We zijn eigenlijk geïnteresseerd in twee vakgebieden. In erster instantie zijn we geïnteresseerd in het onderzoeken van hoe biomoleculen en cellen interageren met kunststof polymeroppervlakken.

Dat is ons overkoepelende kader. Dat werk is belichaamd in microfluïdische toepassingen voor wegwerpdiagnostiek. In het laboratorium maken we dus microfluïdische apparaten.

Bij thermoplastische materialen gebruiken we doorgaans geen PDMS, het rubberachtige materiaal dat de meeste mensen gebruiken voor het maken van microfluidica in het laboratorium. Wij vervaardigen onze apparaten uit thermoplasten. We zijn geïnteresseerd in het gebruik van deze thermoplastische apparaten om moleculaire biologie op microschaal uit te voeren, op zo'n manier dat deze moleculaire biologie in het veld kan worden gedaan, ver verwijderd van een centraal laboratorium.

In de praktijk in het laboratorium betekent dit dat we kleine plastic kaarten maken waarin vaste-fase-extractiekolommen, cellysekolommen of mengkolommen zijn geïntegreerd. We passen daarnaast polymerasekettingreactie op de chip toe als detectietechniek. Al deze componenten zijn geïntegreerd in een klein apparaat dat, vanuit het langetermraperspectief van het onderzoek, uiteindelijk een geïntegreerd handheld apparaat zal worden dat kan worden meegenomen naar het veld of naar omgevingen waar geen grootschalig laboratorium met alle bijbehorende centrifuges, warmte-incubatoren en dergelijke beschikbaar is.

Ideaal gezien willen we kunnen starten met een menselijk monster, zoals bijvoorbeeld bloed, urine, ontlasting of een nasopharyngeaal swab, wat slijm zou zijn. En vervolgens willen we aan de output van de chip een antwoord krijgen of iemand wel of niet besmet is met een specifiek micro-organisme. De manier waarop we dat doen, is door in het monster van de patiënt te zoeken naar het DNA of RNA van dat specifieke micro-organisme, afhankelijk van het type micro-organisme.

De technische uitdagingen die optreden, liggen dus grotendeels aan de kant van de monstervoorbereiding. Wanneer u start met bloed, ontlasting of urine, moet u vanuit een situatie waarin u een onzuiver menselijk monster heeft met veel potentiële deeltjes of inhibitoren voor PCR of andere amplificatietechnieken, naar een eindresultaat gaan. U wilt uiteindelijk een zeer zuiver geëlueerd monster van nucleïnezuren hebben, dat u vervolgens kunt gebruiken om een specifiek DNA of RNA te amplificeren of op te sporen, wat u vertelt of het micro-organisme waarnaar u op zoek bent aanwezig was.

Om deze monsters te zuiveren, moeten er een paar stappen worden doorlopen. Ten eerste moet het monster worden gefilterd, wat afhankelijk van het monster kan bestaan uit grove filtratie of een korte centrifugatiestap voordat het monster op de chip wordt geplaatst. We proberen daarom altijd te beginnen met monsters zoals ze door de clinicus worden aangeleverd.

Voor urine, ontlasting en nasofaryngeale swabs is ons doel dat de clinicus zijn werk uitvoert zoals gebruikelijk en het monster op de normale wijze afneemt. Vervolgens nemen we dat monster en plaatsen we het op de chips. Indien er in die stap nog verdere filtratie nodig is, vindt die filtratie plaats in de chip.

De tweede stap houdt in dat, omdat we moleculaire assays uitvoeren, we de cellen en de micro-organismen in dat monster moeten lyseren. Daarom voeren we vervolgens een lysestap uit, wat meestal inhoudt dat het monster door een filter met een kleine poriegrootte wordt geperst. Soms bevat dat filter ook nanodeeltjes zoals koolstofnanobuizen, die scherpe randen hebben en kunnen worden gebruikt om sommige organismen met robuustere celwanden open te breken, zoals C difficile, een grampositieve bacterie waarmee we werken en die zeer moeilijk te lyseren is.

Daarom moeten we over robuustere lysiskolommen beschikken. Meestal voeren we een gecombineerde chemische en mechanische lysis uit in de chip. Daarna is ons doel om het lysaat te nemen en vervolgens de gezuiverde nucleïnezuren te extraheren.

Vervolgens leiden we het lysaat over een kolom voor vaste-fase-extractie die is geïntegreerd in de microfluïdische chip. Deze kolom voor vaste-fase-extractie is van plastic en is vervaardigd met behulp van foto-geïnitieerde chemie binnen het microfluïdische kanaal nadat dit reeds gefabriceerd was. Bovendien is deze doorgaans geïmpregneerd met silicadeeltjes, omdat we nucleïnezuren willen binden en weer vrijmaken.

In sommige gevallen hebben we oligo DT-beads toegevoegd als we bijvoorbeeld specifiek mRNA willen binden en vrijmaken, of beads met specifieke antilichamen, als we bepaalde eiwitten willen binden en vrijmaken. We kunnen extractiekolommen maken die dit allemaal kunnen. Maar vandaag laten we zien hoe u de sase-extractiekolom met silica-beads maakt.

Nadat we dat hebben gedaan, laten we het lysaat door de silica-kolom lopen; dit werkt precies zoals een Kyogen-kit zou werken in een laboratorium op macroschaal. Vervolgens wassen we om alle ongewenste componenten te verwijderen, zoals alle koolhydraten, lipiden en andere stoffen in het cellysaat en in de rest van de menselijke sample die we niet nodig hebben. Aan het einde elueren we met water.

Wat gunstig is aan deze micro-schaal vaste-fase extractiekolommen, is dat we kunnen elueren met een zeer kleine hoeveelheid water, gewoonlijk in de orde van 1 tot 5 µL. We krijgen bijna alle nucleïnezuren terug die we hebben toegevoegd. We behalen een efficiëntie van ongeveer 70 tot 90% in de eerste 10 µL die we uit dat kanaal terugkrijgen.

Als we dus twee keer wassen met 2 tot 10 µL, krijgen we bijna alle nucleic acids terug die we hebben toegevoegd. Het resultaat is dus niet alleen een schoon monster dat geschikt is voor PCR, maar ook een monster dat veel sterker geconcentreerd is dan wat men zou kunnen bereiken met een standaard bench top kit. Het uiteindelijke doel van al deze technieken voor monstervoorbereiding is om producten te maken die compatibel zijn met ander werk dat in dit veld is verricht.

Zeer mooi werk in het veld dat aantoont dat PCR-amplificatie op een chip kan worden uitgevoerd. De reverse transcriptase-reactie kan op een chip worden uitgevoerd als u met een RNA-virus werkt of als u een genexpressie-experiment wilt doen. Onze monstervoorbereidingstechnieken kunnen direct worden gekoppeld aan PCR op een chip, waardoor het niet langer nodig is om die reiniging en monstervoorbereiding aan de bench uit te voeren.

En, en, en ook de concentratiestap die nodig is om de minimale volumes te verkrijgen die vereist zijn voor gemultiplexte PCR op een kleine chip. De experimenten die we u vandaag laten zien, tonen hoe we de microfluïdische chip assembleren, die gemaakt is van thermoplast en niet van PDMS. Dit vereist een iets ander fabricageproces dan gewoonlijk wordt gebruikt voor het verzegelen van deze chips.

En vervolgens hoe we de licht-geïnitieerde chemie in de chip uitvoeren om de polymeermonolieten te maken die worden gebruikt voor zowel cellyse als voor vaste-fase-extractie. Aan het einde van dat proces, wat op dit moment modulaire processen in het laboratorium zijn, maar geïntegreerd kunnen worden en zijn geworden, verkrijgt u een sterk geconcentreerd monster van nucleïnezuren, RNA en DNA in water, dat vervolgens naar een PCR-module of een andere amplificatiemodule kan gaan waar identificatie van een micro-organisme of een infectie kan plaatsvinden. We hebben momenteel een beurs waar we aan werken waarbij we menselijke monsters beginnen te verzamelen van het Boston Medical Center van patiënten die mogelijk wel of niet geïnfecteerd zijn met Influenza A. Aangezien het griepseizoen is, zijn dat de monsters die we verzamelen.

Vervolgens voeren we in het laboratorium de gouden standaard-assays uit om te bepalen of iemand geïnfecteerd is met Influenza A, wat in feite een kweekassay is die meerdere dagen duurt om uit te voeren. Parallel daaraan laten we deze monsters door de huidige modules van onze chip lopen. We laten ze door de lysiskolom en de vaste-fase-extractiekolom gaan, en voeren vervolgens de PCR uit om te zien hoe we presteren in vergelijking met de gouden standaard-methoden.

Dit is de fase waarin we ons nu bevinden. Als deze experimenten slagen, denk ik dat we over de komende vier tot zes jaar wellicht in een situatie zullen zijn waarin we een geïntegrede chip en een complete assay voor influenza A hebben; we werken daarnaast ook aan Clostridium difficile in ontlastingstests. We zijn er bovendien zeer dicht bij om niet alleen het apparaat, maar ook de assay te hebben geïntegreerd.

Zowel de ontwikkeling van de assay als het ontwerp van de chip moeten dus hand in hand gaan. Voor een specifieke toepassing, om deze tot aan het bed van de patiënt te brengen, is het echt een doelgericht proces. Je moet het monster waarmee je begint en het micro-organisme waarnaar je op zoek bent kennen om de chip te optimaliseren voor gebruik aan het bed.

Ik denk dus dat we niet zo ver verwijderd zijn van het realiseren hiervan in de vorm van een prototype. Dat zijn onze einddoelen, dus ik hoop dat we dat bereiken.