Het beoordelen van neurale stamcellen Motiliteit Met behulp van een agarosegel-based Microfluïdische Device
11 februari 2008
We tonen aan dat de overexpressie van de epidermale groeifactor (EGFR) de beweeglijkheid van neurale stamcellen (NSCs) met behulp van een roman agarose gel op basis microfluïdische toestel verbetert. Deze technologie kan gemakkelijk aan te passen aan andere zoogdiercelsystemen waar mobiele bronnen zijn schaars, zoals menselijke neurale stamcellen, en de doorlooptijd is van cruciaal belang.
Hallo, ik ben Kevin Won. Ik ben een masterstudent engineering in het Biofluids Lab aan Cornell University. Vandaag ga ik het hebben over het gebruik van een microfluïdisch apparaat op basis van agarose om het effect van EGF (epidermale groeifactor) op neurale stamcellen van muizen te bestuderen.
Het apparaat bestaat in essentie uit drie microfluïdische kanalen, elk 150 micron breed. De EGF wordt in een van de zijkanaal gepompt en de buffer wordt in het andere zijkanaal gepompt. Hiermee wordt in feite een statische lineaire chemische gradiënt over het middenkanaal gecreëerd.
Aangezien EGF gemakkelijk door de agarosegel diffundeert, worden de neuronale stamcellen in het middenkanaal gezaaid en wordt de voortgang van hun migratie via een microscoop gevolgd. De apparaten bestonden in essentie uit een bovenlaag van plexiglas met alle in- en uitlaten voor de aansluiting op de buisjes. Daaronder bevindt zich een agarosegelmembraan met daarin vier patroongestuurde apparaten.
Dit wordt omringd door een PDMS-afstandhouder, wat garandeert dat we over het gehele apparaat een constante dikte hebben. De PDMS en de gel worden gemonteerd op een glazen objectglas, dat is gecoat met ect. Dit helpt de cellen om aan het glazen objectglas te hechten.
Daarnaast wordt de roestvrijstalen plaat gebruikt om het gehele apparaat te monteren, waarna we het apparaat met schroeven in een sandwichstructuur samenvoegen. De wildtype-cellijn is getransfecteerd met een retrovirale vector om de wildtype EGF-receptor te overexpresseren, en de delta-cellijn is getransfecteerd met een gemuteerde versie van de EGF-receptor die ervoor zorgt dat deze constitutief actief is zonder het EGF-ligand. Ik zal nu beginnen met het uitleggen van het assemblageproces van ons microfluïdische apparaat.
Eerst heb ik de PDMS-spacer rond de reliëkstructuren van de silicium microkanalen in onze masters geplaatst. Nu ga ik 0,3 gram agarose afwegen. Vervolgens neem ik 10 mL CO2-onafhankelijk medium en voeg dit toe aan de agarose.
Ik ga nu pipetteren om het agros-poeder te mengen met het CO2-onafhankelijke medium. Nu kunnen we het in de magnetron plaatsen. Zoals u nu kunt zien, is het agros vloeibaar geworden, maar er zijn nog enkele korrels overgebleven.
Ik zal dit voorzichtig ronddraaien om de korrel op te lossen en de luchtbellen te verwijderen. Vervolgens giet ik het gesmolten agarose over de reliëken van de silicium-master en ik neem nu een steriel objectglas en plaats dit over de PDMS-spacer. Ik plaats het onder een hoek om te proberen de meeste luchtbellen uit de agarosegel te drukken.
Ik heb druk uitgeoefend en ik blijf druk uitoefenen tot de agaroise-schil is gestold. Na één tot twee minuten is deze gestold. Nu verwijder ik het overtollige agaroise van de objectglas.
De volgende stap is om het glasplaatje voorzichtig weg te schuiven; dit glasplaatje kan worden weggegooid. Nu ga ik proberen om de patroon-agros voorzichtig over te brengen naar een glasplaatje dat ik vooraf heb gecoat met fibronectine. Ik gebruik in feite dit steriel plastic vel om mij te helpen de patroon-agros samen met de PDMS-spacer op te tillen, en ik zal de patroon-agros met de kanalen naar beneden toe op het plaatje overbrengen.
Nu dit stevig op het glazen objectglas is bevestigd, pons ik gaten in de afzonderlijke reservoirs zodat het plastic verdeelstuk toegang heeft tot de kanalen. Hiervoor gebruik ik een kleine metalen pons. Nu zijn we klaar met het ponsen van de gaten in het device.
Ik voeg 500 µL CO2-onafhankelijk medium toe om uitdroging van de microkanalen te voorkomen en laat dit één tot twee minuten rusten. Na één tot twee minuten probeer ik het overtollige medium af te voeren en lijn ik nu de gaten die in het patroon-agros zijn geponst uit met de in- en uitlaatgaten van het plexiglas-manifold. Zodra de gaten zijn uitgelijnd, druk ik stevig aan om een goede afdichting te vormen.
Nu plaats ik het plexiglas-verdeelstuk over de montages van roestvrij staal en zal ik het apparaat voorzichtig samenklemmen met behulp van schroeven. Ik ben er zeer alert op de schroeven niet te strak aan te draaien, omdat dit de kanalen zou kunnen platdrukken, en ik draai de schroeven in de klokrichting vast om te voorkomen dat de agarosegel aan de binnenzijde verschuift. Ik ga 1 mL medium opzuigen en zal deze spuit gebruiken om het apparaat te testen.
En zoals u kunt zien, injecteer ik vloeistof in elk microkanaal en controleer ik of er vloeistof uit elke uitlaat komt. Op dit moment heb ik het geassembleerde apparaat in de klimaatkamer van de microscoop geplaatst. Deze wordt op 37 °C gehouden, zodat het apparaat wordt opgewarmd en gereed is voor het moment dat we de cellen moeten uitzaaien.
En zoals u kunt zien, heb ik de twee Peristaltische pompslangen al door de opstelling geregen. Momenteel spoel ik de slang door met PBS ter voorbereiding op onze experimenten. We gaan nu de slanginstallatie gereedmaken.
Ik ga de slangen van de parasolpomp door de doppen leiden waarin al gaten zijn geponst. Elke slang heeft een specifiek aantal inkepingen, zodat ik zowel de inlaat als de uitlaat van de slang kan identificeren. De slang met vier inkepingen zal de 10 nanogram per mil ontvangen.
De EGF-oplossing zal nu de slang aan het apparaat bevestigen. Ik bevestig deze aan elk apparaat op basis van het aantal inkepingen; dit komt overeen met de oplossing die wordt opgenomen.
Vervolgens bevestig ik de uitlaatslang. We gebruiken een transparante tigon-slang om te controleren of het medium daadwerkelijk door de uitlaatslang stroomt en of er geen blokkades in het kanaal zitten. Nu zal ik de peristaltische pompen starten.
Ik begin nu met de procedure om de cellen in het centrale kanaal te zaaien. Eerst verwijder ik het overtollige medium uit het sensorkanaal. Nu kan ik de cellen zien.
De cellen bevinden zich reeds in suspensie in CO2-onafhankelijke media. Ik heb 60 µL bij de inlaat van het centrale kanaal geplaatst en 20 µL bij de uitlaat. Hopelijk zullen de cellen door zwaartekrachtgestuurde stroming worden geplaatst.
Ik zal deze procedure herhalen voor de andere twee gevoelige kanalen en we zullen dit nu onder de microscoop observeren om te zien of de celbezetting succesvol was. De cellen zijn nu gehecht aan het glazen objectglas en over enkele minuten zullen ze beginnen uit te spreiden en hun unieke morfologie verkrijgen. Vandaag hebben we de assemblage van het eigenlijke apparaat behandeld, de bereiding van de reagentia en de microscopische technieken die ik gebruik om de celmigratie binnen het apparaat in beeld te brengen.
Concluderend hopen we dat dit apparaat een veel bredere toepassing zal vinden, specifiek in een klinische setting. Zo laat figuur 1 horizontaal de trajecten van de C 17.2-cellen zien en verticaal de toenemende EGF-concentraties.
Het toont de trajecten van de verschillende stammen van de C 17.2-cellen die we hebben gebruikt in onze experimenten met dezelfde EGF-concentratie. De gegevens van de ouderlijke cellen laten zien dat er een piek in motiliteit is bij de 10 ng/ml EGF-concentratiegradiënt, wat aangeeft dat de receptoren bij een hogere EGF-concentratie verzadigd zijn geraakt met ligand. En de gegevens van het wildtype tonen aan dat er een toename in motiliteit is bij een concentratie van 100 ng/ml EGF.
Dit geeft aan dat de receptoren niet verzadigd raken bij hogere EGF-concentraties. Dit is logisch, aangezien ze zijn ontworpen om de EGF-receptor over te expresseren. Ten slotte wijzen de gegevens van de delta-cellijn erop dat de motiliteit van de cellen grotendeels onafhankelijk is van de EGF-concentratie.
Dit is ook te verwachten, aangezien de gemuteerde EGF-receptoren zodanig waren ontworpen dat ze onafhankelijk van de aanwezigheid van EGF geactiveerd konden worden.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie demonstreert dat de overexpressie van epidermale groeifactorreceptoren (EGFR) de motiliteit van neurale stamcellen (NSCs) verhoogt met behulp van een nieuw microfluïdisch apparaat op basis van agarosegel. Deze technologie is aanpasbaar aan andere zoogdiercelsystemen waarbij celbronnen schaars zijn.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Microfluidica
Achtergrond
- Epidermale groeifactor (EGF) beïnvloedt het celgedrag.
- Neurale stamcellen (NSCs) zijn cruciaal voor neurale regeneratie.
- Microfluïdische apparaten maken een nauwkeurige controle van cellulaire omgevingen mogelijk.
- Het begrijpen van de motiliteit van NSCs kan bijdragen aan de regeneratieve geneeskunde.
Doel van de studie
- Om het effect van EGF op de motiliteit van NSC's te onderzoeken.
- Om een microfluïdisch apparaat te ontwikkelen voor het bestuderen van cellulaire reacties.
- Om inzicht te verschaffen in het gedrag van NSC's in een gecontroleerde omgeving.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van een microfluïdisch apparaat op basis van agarosegel.
- Creatie van een statische lineaire chemische gradiënt van EGF.
- Observatie van de motiliteit van NSC's als reactie op blootstelling aan EGF.
- Gebruik van microfluïdische kanalen voor nauwkeurige vloeistofcontrole.
Belangrijkste resultaten
- EGFR-overexpressie verhoogt de motiliteit van NSC's aanzienlijk.
- Het microfluïdische apparaat creëert effectief chemische gradiënten.
- De resultaten wijzen op potentiële toepassingen in regeneratieve therapieën.
- De bevindingen kunnen worden aangepast voor humane neurale stamcellen.
Conclusies
- EGF speelt een cruciale rol bij de motiliteit van NSC's.
- Het ontwikkelde apparaat is een waardevol instrument voor cellulaire studies.
- Toekomstig onderzoek kan worden uitgebreid naar andere celtypen en condities.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
De beweeglijkheid van neurale stamcellen dient als een voorspellende biomarker voor tumorigenisch potentieel en ontwikkelingsstoornissen, waardoor een kwantitatieve beoordeling ervan cruciaal is bij targetvalidatie in een vroeg stadium. Het op agarosegel gebaseerde microfluïdische platform maakt reproduceerbare, gradiëntgecontroleerde mobiliteitsassays mogelijk die bijdragen aan het mechanistische de-risking van EGFR-padmodulatoren. Deze benadering vergroot het vertrouwen bij de identificatie van lead-compounds door receptor-overexpressie te koppelen aan functionele fenotypische uitkomsten in een ziekterelevant systeem.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar EGFR-afhankelijke motiliteit mogelijk als functionele readout voor target engagement in neurale stamcellen.
- Operationele waarde: Biedt een gecontroleerde micro-omgeving om EGFR-signalerings effecten te isoleren van storende variabelen in motiliteitsassays.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt fenotypische screening van EGFR-modulatoren door motiliteitsveranderingen onder gedefinieerde chemische gradiënten te kwantificeren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Assay-gereedheid: Genereert kwantitatieve, optische mobiliteitsmetingen die geschikt zijn voor high-content analyse en compound-screening.
- Reproduceerbaarheid: De fabricage van agarosegels waarborgt een consistente kanaalgeometrie en diffusie-eigenschappen over replicaten heen.
- Schaalbaarheid: Patroonvorming van meerdere apparaten in één enkel gelmembraan maakt parallel testen van meerdere condities of cellijnen mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Koppelt de motiliteit van NSC's aan de beoordeling van tumorigenische factoren, ter ondersteuning van preklinische modellen van invasie door hersenkankerstamcellen.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt of EGFR-overexpressie ligand-onafhankelijke motiliteit aanstuurt, wat informatie verschaft voor de selectie van targets voor inhiberende strategieën.
- Translationele continuïteit: Maakt vergelijking mogelijk tussen wild-type, overgeëxprimeerde en constitutief actieve EGFR-varianten om klinische responsprofielen te voorspellen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Het apparaat past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van hypothesen over targets tot lead-optimalisatie, en levert fenotypische gegevens op basis van motiliteit die go/no-go-beslissingen informeren voorafgaand aan preklinische investeringen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten van de rol van EGFR bij de motiliteit van NSC's door middel van nauwkeurige gradiëntcontrole en real-time imaging.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve motiliteitsresultaten die vergelijking van EGFR-modulerende verbindingen of genetische varianten mogelijk maken.
- Analytiek: Genereert metrieken op basis van trajecten die statistische vergelijking van de motiliteit tussen verschillende condities en cellijnen faciliteren.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro bevindingen over motiliteit met de pathofysiologische relevantie in modellen van neurale ontwikkeling en hersenkanker.
- Hergebruik binnen de organisatie: Het agarosegel-platform is aanpasbaar aan andere zoogdierceltypen, wat standaardisatie tussen projecten bij motiliteitsassays ondersteunt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in EGFR-signalering door de receptorstatus te koppelen aan functionele motiliteitsfenotypen.
- Operationele waarde: Waarborgt de reproduceerbaarheid van de assay door gestandaardiseerde gelbinding en gradiëntgeneratie via zijkanaalperfusie.
- Strategische waarde: Verbetert de prioritering van targets door functionele validatie te bieden die verder gaat dan bindings- of expressieassays.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde voortgang van EGFR-gerichte kandidaten mogelijk op basis van op motiliteit gerichte fenotypische risicoreductie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microfluïdische assemblage, het hanteren van agarosegel en live-cell imaging onder gecontroleerde perfusie.
- Afhankelijk van toegang tot perfusiepompen, environmental chambers en geïnverteerde microscopen voor time-lapse motility tracking.
- Vereist standaardisatie van de celzaaidichtheid en geldikte om reproduceerbare diffusiegradiënten en adhesie te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie aan verschillende celtypen op basis van adhesie-eigenschappen en motilititeitskenmerken op met fibronectine gecoate oppervlakken.
- Beperkt door de optische toegankelijkheid van de gelmatrix en potentiële autofluorescentie die bepaalde fluorescentiegebaseerde read-outs beïnvloedt.
