Een methode voor 2-Photon Imaging van de bloedstroom in de neocortex door middel van een Cranial Window

De mogelijkheid om de cerebrale vasculatuur in beeld te brengen en de bloedstroomdynamiek vast te leggen in het intacte brein van levende knaagdieren is een krachtige techniek die kan worden toegepast bij de studie naar cerebrale ischemie of normale hersenfysiologie. Hier zullen we demonstreren hoe twee-fotonmicroscopie kan worden gebruikt om de bloedstroomdynamiek in de neocortex van levende muizen in beeld te brengen met behulp van fluorescerende kleurstoffen die in de staartвена zijn geïnjecteerd. Deze techniek werd oorspronkelijk ontwikkeld door David Kleinfeld en Winfred Dank.

Hoi, ik ben Ricardo Mota van het laboratorium van Carlos Porter Cayo van de afdeling Neurologie aan de University of California Los Angeles. In een vorige video hebben we de methode laten zien voor het implanteren van een schedelvenster voor chronische in vivo imaging-experimenten. Vandaag gaan we de procedure laten zien voor het in beeld brengen van de bloedstroomdynamiek in de cerebrale cortex via een schedelvenster.

Deze preparatie is zeer nuttig omdat het mogelijk maakt om diep in de hersenen te beelden met behulp van tweefoton-lasermicroscopie. Laten we beginnen. Om de cerebrale vasculatuur in beeld te brengen, moeten de dieren intraveneus worden geïnjecteerd met een fluorescerende kleurstof.

Wij maken gebruik van Dexter-geconjugeerde kleurstoffen omdat het dextraan-motief voorkomt dat de kleurstof de bloed-hersenbarrière passeert en uit de bloedvaten lekt. Muizen worden geanestheseerd met isofluraan, 4% voor inductie en 1,5 tot 2% tijdens de injectie. Vervolgens wordt de staart gedesinfecteerd met drie watjes met 70% alcohol; met een naald van 26 gauge worden 75 tot 100 µL van een 5% oplossing van Rhodamine-Dextran opgelost in zoutoplossing via de staartvin geïnjecteerd.

Halverwege de staart kunnen dieren onmiddellijk na de injectie in de staartvene worden afgebeeld tot de kleurstof via de urine wordt uitgescheiden, welke roze zal kleuren bij gebruik van ERO domine-kleurstof. Ongeveer twee uur na de injectie van de fluorescente Dexter-kleurstof wordt de muis geanestheseerd met isofluraan: 4% voor inductie en 1 tot 1,5% voor de beeldvorming. De muis wordt met de titaniumstang stevig aan de microscooptafel bevestigd, welke is voorzien van een thermisch gereguleerde warmtemat om het dier warm te houden.

Er wordt oogzalf aangebracht om de ogen vochtig te houden. Het dekglas van het craniële venster wordt gereinigd met 70% alcohol. Het venster wordt parallel aan het brandvlak geplaatst en in het gezichtsveld gecentreerd.

Met het 4x objectief is het aanbevolen om een foto van de bloedvaten op het breinoppervlak te maken met een digitale camera. Deze foto dient als referentiebeeld in volgende imagingsessies om dag na dag hetzelfde beeldgebied terug te vinden. Het 4x objectief wordt vervolgens vervangen door een 40x waterimmersie-objectief.

Zonder de tafel te bewegen, wordt er een digitale afbeelding van het gezichtsveld gemaakt. Vervolgens worden de coördinaten van de tafelmanipulator opnieuw op nul gezet. We maken gebruik van scan image als software voor beeldacquisitie.

Dit is in MATLAB geschreven door Tom Paul Rudo en Bernardo Sabatini in het laboratorium van Carls Voto. Vervolgens schakelen we alle overige apparatuur in, zoals de laser, de powermeter, de fotomultiplicatieringbuizen, de versterkers, enzovoort. Het deel van het venster dat geschikt is voor beeldvorming, wordt kort gescand bij een lage vergroting om de beste regio's te vinden.

Zodra deze zijn geïdentificeerd, wordt een stack met lage vergroting van het gekozen te beelden gebied gemaakt en worden de XY-coördinaten genoteerd om de bloedstroomdynamiek in kleine vaten of capillairen vast te leggen. We gebruiken linescans over minstens 40 microns van het betreffende vat. Deze enkele sweeps met een duur van één seconde worden uitgevoerd met zo min mogelijk laservermogen, waarbij de coördinaten en de scanhoek worden opgeschreven.

Zodra de imagingsessie is afgelopen, wordt het dier verplaatst naar een warme kamer om zich te kunnen herstellen van de anesthesie. Hier tonen we een stapel van honderd beelden, elke vijf microns genomen met onze tweefotonmicroscoop door een craniële window geplaatst over de somatosensorische cortex van een vijf maanden oude muis die via de staartvin is geïnjecteerd met r Domine dextran. Deze opeenvolging van beelden toont het complexe netwerk van grote en kleine bloedvaten, inclusief haarvaten.

We hebben zojuist een methode gedemonstreerd voor de visualisatie van bloedstroomdynamiek in vivo via een craniële window. Dit is een uiterst krachtige methode voor het in beeld brengen van de cerebrale bloedstroomdynamiek in de corticale vasculatuur, bijvoorbeeld om veranderingen in de bloedstroom na een beroerte te onderzoeken. Meerdere beeldvormingen kunnen op verschillende tijdstippen worden uitgevoerd door middel van herhaalde staartaderinjecties van de fluorescerende kleurstof.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat u onder zo schone en steriele omstandigheden mogelijk is en over een zeer vaste hand beschikt. Oké, dat was het. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.