Analiza fizjologicznego toczkowania leukocytów zapśredniczonego przez E-selektynę na śródbłonku mikrokrążenia

W tym filmie przedstawiono analizę z wykorzystaniem komory przepływowej o równoległych płytkach w celu zbadania czynników wyzwalających toczenie się leukocytów na powierzchniach komórek śródbłonka. Monowarstwy komórek śródbłonka są stymulowane prozaplaną cytokiną IL one beta w celu zwiększenia ekspresji S-selektyny. Następnie komora przepływowa o równoległych płytkach jest umieszczana nad komórkami śródbłonka, a nad monowarstwę wprowadzane są leukocyty wykazujące obecność S-selektyny.

Oddziaływania komórkowe w komorze są zatem poddawane naprężeniom ścinającym, podobnym do tych występujących podczas adhezji leukocytów w naczyniach pokapilarnych. Zdarzenia toczenia są rejestrowane i przeliczane przy użyciu elementów NIS w celu oceny niezależności od E-selektyny. Cześć, jestem George Weis z laboratorium dr. Charlesa de Nitro w Departamencie Dermatologii w Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę analizy roli e-selektyny oraz ligandów E-selektyny w adhezji leukocytów ludzkich do komórek śródbłonka szpiku kostnego człowieka w fizjologicznych warunkach przepływu krwi. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania roli cząsteczek powierzchniowych komórek, które inicjują adhezję białych krwinek lub przerzutowych komórek nowotworowych do komórek śródbłonka wyścielających wewnętrzną powierzchnię naczyń krwionośnych. Zdarzenie adhezyjne to charakteryzuje się zachowaniem przypominającym toczenie, podobnym do ruchu kuli w kręglach toczącej się po torze.

Zacznijmy zatem. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest przygotowanie komórek śródbłonka, które wyścielą komorę przepływową. W tym protokole zastosowano komórki H-B-M-E-C 60 pochodzące z ludzkiego szpiku kostnego.

Naczynia do hodowli mikro naczyniowej powinny zostać uprzednio pokryte fibronektyną; aby je przygotować, należy inkubować naczynia hodowlane o pojemności 35 ml z PBS zawierającym 20 µg/ml fibronektyny. Można je inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub przez trzy godziny w temperaturze 37 °C. Zawiesić komórki H-B-M-E-C 60 w medium 1 99 i wysiać w zagęszczeniu 10⁵ komórek na naczynie, a następnie hodować kultury do uzyskania ponad 90% konfluencji.

Proces ten potrwa około dwóch dni w celu upregulacji e-selektyny i ekspresji; należy odessać pożywkę wzrostową i dodać świeżą pożywkę zawierającą 50 ng/ml IL-1β, a następnie inkubować przez cztery do sześciu godzin. Monowarstwy komórek są teraz gotowe do analizy w komorze przepływowej. Dodatkowe płytki z komórkami HBMEC-60 można stymulować IL-1β i traktować neutralizującym przeciwciałem przeciwko ludzkiej e-selektynie w stężeniu 20 µg/ml przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C.

Będzie to służyć jako kontrola ekspresji funkcjonalnej e-selektyny. Następnie należy przygotować leukocyty pozytywne pod kątem e-selektyny. Są to komórki KG-1a, czyli ludzkie progenitorowe komórki krwiotwórcze.

Komórki te hoduje się w zawiesinie do osiągnięcia konfluencji lub zagęszczenia 6 × 10⁶ komórek/ml w pożywce RPMI 1640. Komórki KG-1A można pipetować bezpośrednio z hodowli i zliczać za pomocą hemocytometru. Resuspenduj komórki do stężenia 10⁶ komórek/ml w buforze HBSS z 10 mM HEPES lub buforze HH zawierającym 2 mM chlorku wapnia.

Przechowywać komórki w lodzie do czasu przeprowadzenia analizy. Kolejne kroki obejmują przygotowanie mikroskopu, równoległej komory przepływowej oraz pompy strzykawkowej. W celu przeprowadzenia analizy należy włączyć mikroskop i pompę strzykawkową.

Wybierz obiektyw 10x w mikroskopie. Umieść probówkę stożkową o pojemności 50 mililitrów w uchwycie i napełnij ją buforem HH z dwumilimolarnym chlorkiem wapnia. Następnie umieść plastikowe probówki testowe o pojemności pięciu mililitrów w uchwycie poniżej.

Następnie umieść strzykawkę 60 ml w pompie strzykawkowej. Upewnij się, że zarówno tłok, jak i korpus strzykawki są stabilnie zamocowane. Do końcówki strzykawki 60 ml podłącz kurek trójdrożny, a następnie do kurka trójdrożnego podłącz strzykawkę 5 ml.

Umieść aparat z komorą przepływu równoległego na stoliku mikroskopu, tak aby rurka wlotowa znajdowała się po prawej stronie, rurka wylotowa po lewej, a rurka próżniowa z tyłu. Po podłączeniu przewodów do pompy próżniowej otwórz zawór powietrza, aby aparat z płytami równoległymi przyległ do stolika. Pozwoli to sprawdzić, czy uszczelka próżniowa komory przepływu jest szczelna.

Po potwierdzeniu szczelności zamknij zawór powietrza. Następnie podłącz linię rurki wyjściowej do trójdrożnego kranu, który jest już połączony ze strzykawką. Aparatura jest teraz gotowa do umieszczenia nad komórkami H-B-M-E-C 60.

Włącz pompę próżniową, ostrożnie opuść aparat z komorą przepływową na płytkę i pozwól, aby urządzenie zostało zassane. Nie powinno być słychać uciekającego powietrza; w tym momencie może być konieczne wywarcie nacisku na komorę, aby ścisnąć gumową uszczelkę. Po wytworzeniu próżni umieść rurkę doprowadzającą w sto pięćdziesięciomililitrowej probówce stożkowej.

Otwórz trójdrożny kurek stopowy do strzykawki 60 ml i przełącz pompę w tryb pompowania, aby usunąć powietrze z przewodów, nie unosząc komórek na płytce. Użyj pompy strzykawkowej ustawionej na dwie ml na minutę, aby wypełnić rurkę doprowadzającą. Następnie szybko zmień ustawienie na 0,5 ml na minutę.

Tuż przed doprowadzeniem cieczy do aparatury kluczowe jest uważne przygotowanie układu (tzw. priming), aby uniknąć pęcherzyków powietrza, które mogłyby oderwać monowarstwę od płytki. Gdy ciecz wpłynie do strzykawki o rozmiarze 60 mil, komora przepływowa oraz pompa strzykawkowa zostaną odpowiednio przygotowane. Następnie należy przymocować komorę przepływową do stolika za pomocą taśmy, zabezpieczając każdą z linii doprowadzającej, odprowadzającej oraz linię próżni.

Zapewnia to stałe pole widzenia podczas wizualizacji i zbierania danych. Komora przepływowa jest teraz gotowa do użycia. Kroki te należy powtórzyć dla każdego cyklu wprowadzania komórek oraz dla każdej nowej płytki.

Aby zarejestrować zdarzenia toczenia w miejscach Lucas, otwórz program NIS elements na pulpicie i naciśnij ikonę odtwarzania, aby uzyskać obraz na żywo. Automatyczna ekspozycja pozwoli na zobaczenie płytki i ustawienie ostrości obrazu. Upewnij się, że mikroskop jest odpowiednio ustawiony na monowarstwę komórek, regulując ostrość ręcznie na mikroskopie.

Po ustawieniu ostrości obrazu, zresetuj ekspozycję do jednej klatki na sekundę i wyreguluj oświetlenie mikroskopu. Obraz powinien pojawić się na komputerze i nie powinien być już widoczny w okularach mikroskopu. Następnie można dostosować histogram światła. Aby usunąć ekspozycję tła lub poprawić wyraźność komórek, kliknij 2x2 bin lub live bin, aby uzyskać obraz idealny do rejestracji filmu.

Kliknij pole „macro” na pasku menu i wybierz „right to port”, następnie wybierz port COM3 i zatwierdź „open”. Operacja ta otwiera port w celu synchronizacji z pompą strzykawkową. Komora przepływowa jest teraz gotowa do infuzji komórek KG-1A; pipetuj 1 ml zawiesiny KG-1A do probówki testowej o pojemności 5 ml znajdującej się w pobliżu linii rurki doprowadzającej.

Następnie umieść linię doprowadzającą na dnie probówki. Przejdź do paska menu i kliknij funkcję przechwytywania oraz akwizycji poklatkowej. Wybierz protokół trwający 210 sekund.

Jest to długość programu dla procesu toczenia na komórkach H-B-M-E-C 60. Każda faza jest zaprogramowana tak, aby wykonywać zdjęcie co sekundę przez cały czas trwania protokołu pompowania. Program jest również skonfigurowany do wysyłania polecenia przez port comm three w celu uruchomienia pompy.

Ustaw pompę strzykawkową w trybie programowania, który umożliwia ręczne programowanie konkretnych szybkości przepływu. Określi to poziomy naprężenia ścinającego w komorze i podyktuje interakcje komórek KG one A z komórkami H-B-M-E-C 60. Parametry dla tych interakcji wynoszą 4,2 dines per centimeter squared przez 45 seconds.

Wartość 3 dyn/cm² utrzymuje się przez 60 s, a następnie co 15 s następuje wzrost do maksymalnej wartości 4,2 dyn/cm². Mikroskop i komputer są teraz gotowe do rejestracji fotografii poklatkowej. Należy nacisnąć przycisk „Start run” na komputerze, aby rozpocząć pozyskiwanie danych podczas uruchamiania programu.

Należy pamiętać o dodaniu pożywki do probówki zawierającej komórki KG one A, aby rurki doprowadzające i odprowadzające pozostały pełne pożywki i zapobiec przedostaniu się pęcherzyków powietrza do systemu. Jeśli sekwencja zdjęć w odstępach czasu (time lapse) zostanie przerwana, pompa nie zatrzyma się automatycznie i musi zostać zresetowana. Naciśnij przycisk anuluj, aby powrócić do obrazu na żywo.

Niepobudzana monowarstwa komórek śródbłonka służy jako kontrola negatywna w tym eksperymencie. W tym celu należy wprowadzić leukocyty KG-1A do komory przepływowej nad niepoddane działaniu czynników komórki HBMEC-60 w celu wykluczenia zależności od E-selektyny; następnie należy pobudzić monowarstwę komórek śródbłonka za pomocą IL-1β i wprowadzić leukocyty nad te komórki, aby dodatkowo wykluczyć zależność od E-selektyny. Komórki HBMEC-60 należy poddać działaniu IL-1β, a następnie przeciwciała anty-ludzkiej P-selektyny.

Następnie analizuje się zdarzenia toczenia leukocytów na tych komórkach. Toczenie komórek jest determinowane nie tylko przez selektynę S, ale także przez reszty kwasu sialowego na powierzchni komórki leukocytu. Aby to wykazać, poddaje się komórki KG one A trawieniu neuraminidazą w stężeniu 0,1 jednostek na ml przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C.

Następnie przeanalizuj zdarzenia toczkowania na stymulowanych komórkach H-B-M-E-C 60. Glikoproteiny na powierzchni leukocytów są również istotne dla toczkowania komórek. Można to zademonstrować, traktując komórki KG one A 0,2 j/ml bromelaniny przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie wprowadzając je do komory przepływowej.

Po zarejestrowaniu sekwencji czasowej dane są gotowe do analizy. Zapisz dane, przejdź do karty pomiarów (measure) na pasku menu i wybierz zdefiniowany próg (defined threshold). Przesuń suwaki tak, aby pożądane komórki zostały zaznaczone na czerwono, zaznacz wszystkie obrazy, a następnie zatwierdź przyciskiem OK; cała sekwencja time-lapse powinna zostać teraz zmodyfikowana, ukazując widoczne czerwone, toczące się komórki.

Przejdź do pomiaru i wybierz ograniczenia. Pozwala to użytkownikowi wykluczyć obiekty przekraczające próg, które nie reprezentują toczących się komórek. Są to głównie elementy tła powstałe w wyniku wyboru obszaru monowarstwy H-B-M-E-C 60; wprowadź wartości minimalne i maksymalne, które są optymalne dla toczących się leukocytów.

Powtórz ten krok dla elongacji i kolistości. Wybierz measure, a następnie wybierz create binary using restrictions. Te same wartości restrykcji, które zostały ustawione w poprzednim kroku, zostaną teraz wykorzystane do optymalizacji oprogramowania NIS elements w celu rozpoznawania toczących się leukocytów na monowarstwie komórek śródbłonka. Powróć do measure, wybierz field data, a następnie wybierz reset data.

Zamknij menu, powróć do pomiaru i wybierz pole skanowania, otwórz dane pola pomiarowego, a następnie wybierz liczbę obiektów. Następnie zaznacz wszystkie pola i wyeksportuj dane do programu Microsoft Excel. Na koniec wybierz opcję wyczyść dane.

Elementy NIS są teraz gotowe do dalszego gromadzenia danych. Te reprezentatywne dane pokazują, w jaki sposób oddziaływania leukocytów z komórkami śródbłonka reagują na fizjologiczny stres ścinający, konkretnie testując rolę liganda adhezyjnego E-selektyny.

Intensywne toczenie się leukocytów występuje, gdy komórki śródbłonka zostaną wstępnie pobudzone IL-1β. Porównując ten wynik z niepobudzoną próbą kontrolną, można stwierdzić, że toczenie się komórek zależy od stymulacji cytokinami. Poprzez potraktowanie komórek HBMEC-60 IL-1β, a następnie przeciwciałem przeciwko ludzkiej selektynie E, staje się jasne, że toczenie się komórek zależy konkretnie od selektyny E.

Niniejszy test może być również wykorzystany do badania innych parametrów. Na przykład, gdy komórki stymulowane są poddane wstępnej obróbce sase lub brolinem, wyniki są mniej wyraźne. Dane te podkreślają znaczenie terminalnych reszt kwasu sjalowego, jak również glikoprotein powierzchniowych komórek.

W przypadku badania aktywności liganda selektyny S, zaprezentowaliśmy właśnie sposób analizy oddziaływań adhezyjnych opartych na e-selektynie pomiędzy leukocytami a komórkami śródbłonka w warunkach naśladujących siły występujące w żyłkach posutylarnych, czyli w regionie układu krwionośnego, w którym leukocyty opuszczają krew i wnikają do tkanek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zastosowaniu odpowiedniego przeciwciała blokującego lub kontroli z użyciem obróbki enzymatycznej w celu potwierdzenia niezbędności danej selektyny oraz jej liganda w tym systemie analizy. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.