Badanie trajektorii toczenia się komórek na asymetrycznych wzorach receptorów
13 lutego 2011
Opisujemy protokół obserwacji i analizy trajektorii toczenia się komórek na podłożach z asymetrycznym wzorem receptorów. Uzyskane dane są przydatne przy projektowaniu podłoży z wzorem receptorów do bezznakowej separacji i analizy komórek.
Niniejszy protokół opisuje obserwację i analizę trajektorii toczenia się komórek na asymetrycznych wzorach receptorów, co ma na celu ułatwienie projektowania podłoży z wzorami receptorów do bezznacznikowej separacji i analizy komórek. Procedurę rozpoczyna się od mikrokontaktowego drukowania cząsteczek PEG na złotym podłożu w celu stworzenia naprzemiennych wzorów samozgromadzone monowarstw, a następnie wypełnienia pozostałych przestrzeni podłoża receptorami P-selectyny. Następnie podłoże montuje się w komorze przepływowej. Do komory wprowadza się komórki HL 60 w przepływie.
Należy zarejestrować sekwencję obrazów reprezentującą interakcję toczącą się komórek HL 60 na wzorach P-selektyny, a następnie przeanalizować obrazy przekonwertowane z wideo. Trajektorie toczących się komórek, długość śledzenia krawędzi oraz prędkości toczenia się na płaszczyźnie, w obszarze i na krawędzi mogą zostać uzyskane za pomocą programu MATLAB. Metoda ta pozwala zrozumieć, w jaki sposób komórki HL 60 poruszają się na asymetrycznych wzorach receptorów w przepływie ścinającym.
Metodę tę można zastosować do kwantyfikacji innych oddziaływań powierzchniowych komórek, bezpośredniej analizy komórek poprzez obserwację ich trajektorii na wzorach receptorów oraz do projektowania urządzeń mikroskalowych do separacji komórek. Drukowanie mikrokontaktowe jest wykorzystywane do tworzenia naprzemiennych wzorów samoorganizujących się monowarstw cząsteczek peg na podłożu złota.
Najpierw nanieś na stempel PDMS roztwór PEG o stężeniu 5 mM w etanolu. Susz powierzchnię przez 20 minut. Delikatnie przyłóż stempel do powierzchni złota na 40 sekund, upewniając się, że zachodzi dobry kontakt między powierzchnią złota a stemplem.
Nadciśnienie nie jest wymagane. Przepłucz powierzchnię etanolem i osusz strumieniem azotu. Następnie, używając komory perfuzyjnej, inkubuj podłoża w roztworze P-selektyny o stężeniu 15 µg/mL przez trzy godziny w temperaturze pokojowej, aby pokryć pozostałe obszary P-selektyną; przepłucz komorę, a następnie wypełnij pozostałe wolne miejsca BSA o stężeniu 1 mg/mL przez jedną godzinę, aby zablokować niespecyficzne oddziaływania.
Przed przeprowadzeniem eksperymentu z toczeniem się komórek należy przepłukać powierzchnię buforem DPBS. Złożyć komorę przepływową, a następnie przepuścić zawiesinę komórek HL 60 o stężeniu 10⁵ komórek/ml nad powierzchniami z wzorem w prostokątnej komorze przepływowej z kątem nachylenia wzoru receptorów wynoszącym 10 stopni.
W temperaturze pokojowej 24,5 °C. Ustaw pompę strzykawkową tak, aby uzyskać szybkość przepływu 75 µL/min z odpowiadającym jej laminarnym naprężeniem ścinającym 0,5 dyn/cm². Następnie, korzystając z mikroskopu odwróconego i zamontowanej kamery, zarejestruj toczenie komórek HL 60.
Interakcje z adhezywną P-selektyną i podłożami. Przy użyciu obiektywu 4x przy szybkości jednej klatki na sekundę przez czas 300 sekund. Przeprowadzić trzy niezależne eksperymenty.
Dane należy przedstawić jako średnią i odchylenie standardowe wartości średnich uzyskanych z każdego eksperymentu. Zdjęcia mikroskopowe przekonwertowane z nagrania wideo HL 60.Rolling. Interakcje z adhezyjnym p-selektyną i podłożami wykazują jasne i ciemne obszary odpowiadające odpowiednio receptorom p-selektyny oraz obszarom PEG.
Ślady są wyznaczane przy użyciu dostosowanego programu MATLAB. Kąt nachylenia krawędzi wynosił 10 stopni, a naprężenie ścinające 0,5 dines na centymetr kwadratowy. Dalsze analizy oparto na rozkładzie długości śledzenia krawędzi, średniej wartości długości śledzenia krawędzi, a także VE i VP, czyli prędkościach toczenia się na krawędziach i wewnątrz pasm.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, w jaki sposób badać trajektorie komórek w asymetrycznych wzorcach receptorów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje obserwację i analizę trajektorii toczenia się komórek na asymetrycznych wzorach receptorowych, aby ułatwić projektowanie podłoży z wzorami receptorowymi do bezetykietowej separacji i analizy komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Biomateriały
- Mikroprzepływy
Wprowadzenie
- Turlanie komórek jest kluczowym procesem w wielu oddziaływaniach biologicznych.
- Asymetryczne wzory receptorowe mogą wpływać na zachowanie komórek.
- Techniki bezetykietowe są niezbędne do separacji i analizy komórek.
- Mikrodruk kontaktowy jest użyteczną metodą tworzenia podłoży wzorzystych.
Cel badania
- Opracowanie protokołu obserwacji toczenia się komórek na podłożach z wzorem receptorowym.
- Analiza trajektorii toczących się komórek w celu usprawnienia inżynierii podłoży.
- Zapewnienie wglądu w dynamikę ruchu komórek w warunkach przepływu.
Zastosowane metody
- Mikrodruk kontaktowy cząsteczek PEG na złotym podłożu.
- Tworzenie naprzemiennych wzorów samozorganizujących się monowarstw.
- Wypełnianie pozostałych wolnych przestrzeni podłoża P-selektyną oraz receptorami.
- Implementacja w komorze przepływowej i obrazowanie komórek HL-60 toczących się po wzorach.
Główne wyniki
- Nagrano sekwencje obrazów oddziaływań komórek HL-60.
- Trajektorie toczących się komórek przeanalizowano za pomocą programu MATLAB.
- Uzyskano dane dotyczące długości śledzenia krawędzi oraz prędkości toczenia się komórek.
- Przedstawiono wnioski dotyczące ruchu komórek na asymetrycznych wzorach receptorów.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia szczegółową analizę dynamiki toczenia się komórek.
- W celu skutecznej separacji komórek można zaprojektować asymetryczne wzory receptorów.
- Metoda ta przyczynia się do zrozumienia zachowania komórek w przepływie ścinającym.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie trajektorii toczenia się komórek po asymetrycznych wzorach receptorów umożliwia racjonalne projektowanie bezetykietowych mikrofluidycznych urządzeń separacyjnych. Niniejszy protokół dostarcza ilościowych danych na temat długości śledzenia krawędzi oraz prędkości toczenia się w określonym naprężeniu ścinającym, co wspiera modelowanie predykcyjne zachowania komórek w przepływie. Takie spostrzeżenia ograniczają liczbę empirycznych iteracji w inżynierii urządzeń przeznaczonych do oczyszczania komórek oraz analizy fenotypowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie kinetyki wiązania ligand-receptor w warunkach fizjologicznego ścinania, co dostarcza informacji niezbędnych do walidacji celów w obrębie szlaków zależnych od adhezji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia metodę bezznacznika do oceny funkcjonalnej aktywności receptorów bez konieczności stosowania znaczników fluorescencyjnych lub reporterów genetycznych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych wyników prędkości toczenia się komórek oraz długości śledzenia krawędzi w celu analizy porównawczej dla różnych gęstości receptorów lub geometrii wzorów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie podłoża za pomocą mikrostemplowania oraz integracji z komorą przepływową, co umożliwia powtarzalne testy adhezji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka strategii separacji opartych na adhezji poprzez powiązanie projektu wzorca receptorów z obserwowalnymi wynikami trajektorii komórek.
- Wartość operacyjna: Umożliwia przesiewanie fenotypów komórkowych na podstawie zachowania tocznego, co jest użyteczne przy wzbogacaniu subpopulacji w modelach przedklinicznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w początkową fazę odkrywania leków, służąc jako podstawa do opracowania analiz i tworzenia narzędzi przedklinicznych, szczególnie w przypadku celów molekularnych, w których adhezja w przepływie stanowi funkcjonalny odczyt.
- Biologia odkryć: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących oddziaływań receptor-ligand w przepływie ścinającym, wyjaśniając mechanistyczny wkład w proces toczenia się komórek.
- Screening: Dostarcza standaryzowanych, ilościowych mierników adhezji, umożliwiających porównywanie linii komórkowych lub modulatorów receptorowych.
- Analityka: Generuje rozkłady długości śledzenia krawędzi oraz prędkości toczenia, zapewniając statystyczną podstawę do porównania warunków.
- Badania translacyjne: Łączy dynamikę toczenia in vitro z potencjalną użytecznością w urządzeniach do bezmarkerowej separacji komórek w przedklinicznym przetwarzaniu próbek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do oceny zachowania komórek zależnego od adhezji dla wielu celów i typów komórek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do mechanizmów separacji opartych na adhezji poprzez ilościowe określanie parametrów trajektorii w kontrolowanym ścinaniu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji druku mikrokontaktowego, wypełnianiu receptorów (backfilling) oraz konfiguracji komory przepływowej.
- Wartość strategiczna: Redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach opracowywania urządzeń, umożliwiając wczesną walidację funkcjonalną wzorów receptorowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje typu go/no-go dla technologii separacji mikrofluidalnych poprzez dostarczenie empirycznych danych na temat wydajności wzorów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie druku mikrokontaktowego, chemii powierzchni oraz mikrofluidycznej kontroli przepływu.
- Zależne od dostępu do odwróconej mikroskopii w polu jasnym, kamery wysokich prędkości oraz narzędzi do śledzenia cząstek opartych na programie MATLAB.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji wytwarzania podłoży oraz raportowania warunków przepływu w celu zapewnienia powtarzalności w wielu ośrodkach.
- Adaptacja do alternatywnych typów komórek wymaga walidacji par ligand-receptor oraz optymalizacji parametrów naprężenia ścinającego.
- Ograniczone przez przejściowy charakter oddziaływań na krawędziach komórek, co utrudnia pełną rekonstrukcję trajektorii i wymaga analizy segmentowej.
