Analiza ekspresji genów w morskich społecznościach drobnoustrojów z wykorzystaniem transkryptomiki środowiskowej

Procedura ta rozpoczyna się od pozyskania morskiej biomasy mikrobiologicznej z próbek wody poprzez wstępną filtrację przez filtry o rozmiarze pięciu i trzech mikrometrów, a następnie zbieranie na filtrze 0,22 mikrometra. Następnie z organizmów zatrzymanych na filtrze 0,22 mikrometra ekstrahuje się całkowite RNA. RNA rybosomalne jest usuwane z całkowitego RNA poprzez selektywną degradację enzymatyczną i hybrydyzację subtrakcyjną, a wzbogacony Mr.N jest amplyfikowany liniowo za pomocą dodawania ogona polyA i transkrypcji in vitro.

Wzmocniony antysensowny RNA jest następnie konwertowany w dwuniciowe cDNA przy użyciu losowych heksamerów. Otrzymane cDNA może zostać sklonowane i zsekwencjonowane lub poddane bezpośredniemu pirosekwencjonowaniu. Cześć, jestem Rachel Persky z laboratorium dr Marianne Moran z Katedry Nauk Morskich Uniwersytetu Georgijskiego.

Dzisiaj przedstawimy procedurę analizy ekspresji genów w próbkach środowiskowych z wykorzystaniem środowiskowej metatranskryptomiki. Scott Gifford pokaże, jak przygotować próbki środowiskowe do izolacji RNA.

Pokażę Państwu, jak wyizolować RNA z próbek i wyznaczyć wartości RIN. AON zaprezentuje proces usuwania RNA. Następnie Maria Kosta omówi etapy amplifikacji RNA oraz syntezy cDNA.

Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć pobieranie środowiskowego RNA, przygotowujemy system linii filtracyjnej, umieszczając jeden koniec rurki w wodzie na pożądanej głębokości poboru próbek i przyłączając przeciwległy koniec do filtra o wysokiej przepływności o rozmiarze oczek 3 µm, umieszczając pompę pomiędzy obiema końcami rurek. Następnie filtr 3 µm zostaje podłączony do kolumny z filtrem 0,22 µm, a odpływ jest skierowany z kolumny 0,22 µm do menzurki.

Przepuść przez system kilka litrów wody w celu płukania. Po zakończeniu, podczas pracy pompy, wyjmij rurkę z wody, aby usunąć pozostałą wodę z przewodu. Następnie, za pomocą pęsety, umieść filtr 0,22 µm na wieży filtracyjnej i zamknij ją.

Umieść koniec przewodu z powrotem w wodzie i uruchom pompę. Pozwól na odpowietrzenie obu filtrów i monitoruj objętość przefiltrowanej wody w kanistrze. Po przefiltrowaniu pożądanej objętości wyjmij przewód z wody i usuń pozostałą wodę z układu.

Gdy tylko filtr wyschnie, szybko zdejmij górną płytkę filtra i złóż papier filtracyjny. Umieść filtr w probówce typu whirl pack i zamroź gwałtownie w ciekłym azocie. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy pamiętać, że ze względu na powszechną obecność RNA oraz szybką degradację mRNA, należy przestrzegać standardowych środków ostrożności obowiązujących w środowisku wolnym od rybonukleaz, w tym w odniesieniu do powierzchni roboczych i pipet.

Mając to na uwadze, podczas pracy z wszelkimi materiałami wykorzystywanymi w tej procedurze należy nosić czyste rękawiczki. Próbki powinny być przetwarzane w jak najkrótszym czasie. Aby rozpocząć ekstrakcję całkowitego RNA z filtra o rozmiarze 0,22 µm, przygotowujemy probówki do homogenizacji kuleczkowej, dodając osiem mililitrów buforu RLT z dodatkiem beta-metanolu do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.

Następnie dodaje się od jednego do dwóch mililitrów kulek do izolacji RNA z zestawu do ekstrakcji gleby mobile power. Szybko wyjmij zamrożony filtr z zamrażarki, zachowując go w opakowaniu world pack. Rozkrusz go za pomocą młotka.

Przenieś rozdrobniony filtr do przygotowanej probówki stożkowej o pojemności 50 ml i zabezpiecz zakrętkę probówki parafilmem lub taśmą laboratoryjną, a następnie mieszaj w wirówce wortex przez 10 minut. Następnie wiruj probówkę 50 ml z prędkością 5 000 RPM przez jedną minutę. W temperaturze pokojowej usuń jak największą ilość lizatu i przenieś go do probówki 15 ml, a następnie ponownie wiruj przez pięć minut.

Następnie, po wirowaniu przy 5 000 ×g, nadfiltr przenosi się do nowej probówki o pojemności 50 ml, a do lizatu dodaje jedną objętość 100% etanolu. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml należy wciągnąć lizat przez igłę o rozmiarze od 18 do 21 G i wypuścić go z powrotem, powtarzając tę czynność około pięciu razy. W kolejnych etapach ekstrakcji należy zastosować zestaw KaiGen R and easy mini zgodnie z instrukcją producenta, nanosząc lizat na dołączoną kolumnę przy użyciu manifoldu próżniowego lub poprzez wielokrotne wirowanie.

Ilość całkowitego RNA należy oznaczyć spektrofotometrycznie. Po określeniu wydajności całkowitego RNA, wykorzystujemy zestaw Ambien turbo DNA free zgodnie z instrukcjami producenta w celu usunięcia zanieczyszczeń DNA. Po zakończeniu ekstrakcji RNA, przekazuję całkowite RNA Johannie, która przeprowadzi pierwszy i drugi etap usuwania rRNA.

Dziękuję, Rachel. Aby rozpocząć usuwanie rRNA, przed użyciem delikatnie wymieszaj i krótko odwiruj 10-krotny bufor reakcyjny w sterylnej probówce 0,5 ml wolnej od RNA, a następnie połącz odpowiednie objętości 10-krotnego buforu reakcyjnego, inhibitora RNA, próbki całkowitego RNA oraz terminazy egzonukleazy. Zgodnie z protokołem firmy Epicentre, inkubuj reakcję w temperaturze 30 °C przez 60 minut w termocyklerze z grzaną pokrywą lub w kąpieli wodnej.

Następnie reakcję przerywa się poprzez wytrącanie w fenolu i etanolu, najpierw dodając RNase-free water do całkowitej objętości 200 µL, a następnie dodając jedną objętość roztworu fenol-chloroform w stosunku 1:1 do mRNA i wirując w wirówce. Należy zebrać fazę wodną, a następnie wytrącić kwas nukleinowy przy użyciu 100% etanolu i soli. Jest to potencjalny punkt przerwania procedury.

RNA można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu wykorzystania próbki w dalszych zastosowaniach. Po zakończeniu pierwszego wzbogacenia mRNA, użyjemy zestawów Ambien microbe enrich oraz microbe express zgodnie z instrukcjami producenta, aby usunąć z próbki pozostałości rRNA. W celu ułatwienia usunięcia eukariotycznego rRNA zastosujemy zestaw microbe enrich.

Wszystkie objętości należy określić na podstawie instrukcji producenta. Na początek należy pipetować 300 µL buforu wiążącego do probówki o pojemności 1,5 ml. Następnie należy dodać od 5 do 100 µg całkowitego RNA w maksymalnej objętości 30 µL i wymieszać na wibratorze (vortexu).

Ostrożnie dodaj 2 µL mieszaniny oligosond wychwytujących dla 5 µg RNA do buforu wiążącego i delikatnie stuknij probówkę. Krótko odwiruj mieszaninę. Denaturuj mieszaninę w temperaturze 70 °C przez 10 minut, a następnie inkubuj ją w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.

Podczas tej inkubacji przygotować magnetyczne kulki z oligonukleotydami, przepłukując je raz w wodzie wolnej od nukleaz oraz raz w buforze wiążącym, przechwytując kulki na statywie magnetycznym pomiędzy płukaniami. Kulki przechowywać na lodzie, a następnie doprowadzić do temperatury pokojowej. Na pięć minut przed użyciem podgrzać roztwór płuczący do 37 °C w bloku grzejnym.

Do wypłukanych magnetycznych kulek z oligosami dodaj mieszaninę oligosów do wychwytu RNA, delikatnie wymieszaj zawartość probówki i odwiruj. Inkubuj mieszaninę przez 15 minut w temperaturze 37°C. Umieść probówkę w statywie magnetycznym i odczekaj około trzech minut, a następnie odessij supernatant zawierający mRNA i przenieś go do probówki zbiorczej w lodzie.

Następnie należy dodać 100 µL uprzednio ogrzanego roztworu piorącego do wychwyconych kulek. Następnie należy delikatnie wymieszać kulki w wstrząsarku wierzchołkowej i zebrać nadsącz. Nadsącz zawierający mRNA należy przenieść do probówki zbiorczej na lodzie.

Umieść probówkę do zbierania na lodzie, przygotowując się do usunięcia prokariotycznego rRNA za pomocą zestawu ambi microbe express, którego użyjemy do usunięcia pozostałego prokariotycznego rRNA. Użyj systemu Bioanalyzer lub Experion, aby sprawdzić zanieczyszczenie rRNA oraz jakość mRNA. Jest to potencjalny punkt przerwania procedury.

RNA można przechowywać w temperaturze -80 °C. Po usunięciu rRNA wykorzystamy zestaw Ambien message AMP two bacteria zgodnie z instrukcją producenta, aby przeprowadzić amplifikację mRNA. Teraz, gdy dysponujemy czystą próbką mRNA, przekazuję eksperyment Marii, która przeprowadzi Was przez proces amplifikacji mRNA oraz syntezy cDNA.

Dziękuję, Hannah. Przed rozpoczęciem amplifikacji mRNA należy obliczyć objętości każdego składnika mieszanin master mix z zestawu Ambien message AMP two bacteria online. Następnie rozpoczynamy poliadenylację RNA matrycowego, umieszczając do 1000 ng całkowitego RNA w sterylnej, wolnej od RNazy probówce do wirówki. Należy użyć 6,5 µl próbki oraz wody wolnej od RNazy w pierwszym buforze, aby zsyntetyzować RNA poprzez transkrypcję in vitro.

Zaleca się stosowanie pieca do hybrydyzacji lub inkubatora ze względu na zapewnienie jednolitej temperatury. Ponieważ niezwykle ważne jest, aby wewnątrz probówek nie tworzył się kondensat, zdecydowanie zalecamy inkubację reakcji transkrypcji in vitro przez 14 godzin. Aby zmaksymalizować wydajność RNA i uzyskać najwyższą ilość A RNA, należy przeprowadzić IBT w końcowej objętości reakcji 40 µL i przechowywać A RNA w temperaturze -80 °C w aliquotach o objętości około 10 µL.

Po amplifikacji RNA należy przystąpić do syntezy DNA komplementarnego, czyli cDNA. Do syntezy cDNA z RNA wykorzystuje się zestaw Promega universal ribot Clone cDNA synthesis system. Zestaw zawiera instrukcje konwersji 2 µg RNA do cDNA. Zaleca się jednak użycie od 6 do 10 µg RNA i odpowiednie przeskalowanie reakcji.

Oczyść cDNA za pomocą wytrącania etanolem lub systemu oczyszczania DNA Promega Wizard. Zgodnie z instrukcjami producenta, przechowuj próbki w temperaturze -80 °C. Dwuniciowe cDNA można w tym punkcie poddać bezpośredniemu sekwencjonowaniu. Z 10 litrów wody morskiej wyekstrahowaliśmy około 10 µg środowiskowego RNA i przeprowadziliśmy 20-krotną amplifikację. Poprzez konwersję amplifikowanego mRNA do dwuniciowego cDNA wygenerowano ilość materiału wystarczającą do sekwencjonowania i analizy transkryptyw środowiskowych. Właśnie pokazaliśmy, jak oceniać ekspresję genów w morskich społecznościach drobnoustrojów, wykorzystując środowiskową metatranskryptomikę.

Należy pamiętać, że podczas wykonywania tej procedury mRNA ulega szybkiej degradacji, a RNazy są powszechnie występujące. Należy zatem zachować standardowe środki ostrożności podczas pracy w środowisku wolnym od RNaz i przetwarzać próbki tak szybko, jak to możliwe. To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.