Wizualizacja antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z wykorzystaniem tetramerów MHC klasy II

Tym, co czyni test TEER naprawdę wyjątkowym, jest możliwość bezpośredniej wizualizacji limfocytów T specyficznych dla antygenu. Pomiar TEER stanowi główny, unikalny aspekt naszego testu, który łączymy z etapem amplifikacji.

Jak państwo wiedzą, izolujemy limfocyty T, a następnie hodujemy je w środowisku, które wzbogaca próbkę o limfocyty T, na których nam zależy. Dzięki temu jesteśmy w stanie specyficznie oznakować tylko te komórki i zwizualizować je za pomocą cytometru przepływowego. W przypadku wcześniejszych testów, takich jak CFSE czy testy proliferacji stosowane od dziesięcioleci, otrzymuje się jedynie ogólne pomiary zbiorcze dotyczące tego, co dzieje się z całą populacją limfocytów T.

W organizmie znajdują się jednak miliony limfocytów T, które rozpoznają cały zróżnicowany zestaw wzorców. Jeśli będziesz mieć szczęście, być może jedna na dwa do 300 000 komórek w próbce będzie tą, której poszukujesz. Właśnie dlatego w tym teście zastosowano etapy wzbogacania.

Następnie, dzięki numeracji testów oraz bezpośredniemu barwieniu, można w rzeczywistości zwizualizować, oddzielając sygnał od tła, populację stanowiącą mniej niż 1% całkowitej liczby komórek. Pozwala to dostrzec bardzo niewielkie różnice i uzyskać dość precyzyjną liczbę limfocytów T w danej próbce krwi, czyli u konkretnego osobnika, które rozpoznają interesujący nas wzór. Na tym jednak możliwości się nie kończą, ponieważ tetramery pozwalają nie tylko na znakowanie tych limfocytów T, ale również na ich izolację do dalszych analiz.

A tetery, których Państwo używają, są w rzeczywistości produkowane tutaj, w BRI, czy to prawda? Tak. Jesteśmy jednym z niewielu laboratoriów w kraju, którym udało się stworzyć tetery klasy drugiej. Naszym celem jest dystrybucja tych odczynników po kosztach do wszystkich laboratoriów zainteresowanych wdrożeniem tej technologii.

Jakie aspekty tego testu uznałby Pan za najtrudniejsze lub najbardziej problematyczne w kontekście jego powtórzenia w innych laboratoriach? Cóż, zastanawiając się nad tym, widzę dwa główne wyzwania; jednym z nich jest hodowla limfocytów T. Jest to kwestia, która w pewnym sensie jest niemalże sztuką.

Prawie każdego dnia musi Pan/Pani podejmować decyzje dotyczące tego, czy komórki potrzebują dodatkowych składników odżywczych lub więcej miejsca do wzrostu. A następnie pojawia się druga część, która moim zdaniem jest prawdopodobnie najtrudniejsza dla niedoświadczonego operatora, czyli właściwa analiza danych. Polega ona na ustaleniu, która część sygnału jest rzeczywistą odpowiedzią pozytywną, a która wynika po prostu z, wie Pan/Pani, praw fizyki i oddziaływań przyciągania.

Fakt, że wszystko wykazuje pewien stopień lepkości, jest kwestią, która ponownie wymaga dużego doświadczenia, zwłaszcza w kontekście, w którym całkowita odpowiedź będzie nieco słaba. W jaki sposób informacje wygenerowane za pomocą tego testu mogą przynieść korzyść pacjentom na tym etapie? Jedną z pierwszych cech charakterystycznych, które pojawiają się u każdego pacjenta z chorobą autoimmunologiczną, jest swoisty dla danej choroby zespół przeciwciał.

Z podstawowych zasad immunologii wiemy, że każdej odpowiedzi przeciwciałowej zawsze towarzyszy uprzednio odpowiedź komórek T. Zatem, gdybyśmy mogli zaobserwować u osób z grup ryzyka ten wzrost aktywności komórek T poprzedzający powstawanie przeciwciał, pomogłoby nam to zdefiniować nowy poziom ryzyka u osób predysponowanych do wytwarzania autoprzeciwciał, co z kolei mogłoby otworzyć okno czasowe dla terapii interwencyjnych. Niniejsza procedura służy do oczyszczania i namnażania swoistych dla antygenu komórek T CD4+ oraz ich wizualizacji z wykorzystaniem odczynników i sprzętu teters w komorach z laminarnym przepływem powietrza klasy bezpieczeństwa biologicznego 2.

Będzie to główny obszar roboczy dla procedury. Probówki stożkowe 50 ml jako główne probówki do izolacji PBMC oraz XPBS. Roztwór ten powinien być wolny od wapnia i magnezu, zapakowany w folię w celu ochrony przed światłem, pomocnik do pipetowania, pipety CoStar 10 ml oraz kanistry z wkładkami 50 ml stosowane w celu zapobiegania zanieczyszczeniu wirówki krwią.

Pipety transferowe GS six R, pipety Pasteura, bufor hemolityczny zawierający 8,3 g/L chlorku amonu, 1,0 g/l wodorowęglanu sodu, 0,04 g/l DI EDTA sodowego, 0,2% roztwór błękitu trypanu w PBS, hemo-cytometr, stożkowata probówka 15 ml, bufor roboczy zawierający PBS uzupełniony o 2 mM EDTA oraz 5 g/l.

Zestaw do izolacji BSA max CD four zakupiony od Milin biotech, blok magnetyczny EP zakupiony od stem cell technologies. Z równą skutecznością można zastosować inne platformy do magnetycznego wzbogacania komórek. Polipropylenowe probówki 5 ml, RPMI 1640 uzupełnione o 25 millimolar hippies do przygotowania medium dla limfocytów T, pulowany ludzki surowica do uzupełnienia medium dla limfocytów T, pen strip do uzupełnienia medium dla limfocytów T, filtr nakrętkowy 0,22 mikrona 500 ml, sterylna płytka 48-dołkowa stosowana do ekspansji in vitro, inkubator CO2 37°C, roztwór syntetycznego peptydu zawierający interesujący epitop o stężeniu 20 mg/ml.

Użyto pięciomililitrowych polistyrenowych probówek FACS z filtrem o gęstości 40 µm w celu wizualizacji T-komórek specyficznych dla antygenu; do znakowania tych komórek wykorzystano przeciwciała anty-CD3, anty-CD4 oraz anty-CD25. Do analizy wykorzystano cytometr przepływowy FACS Caliber lub urządzenie równoważne. Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować wszystkie materiały i sprzęt w miejscu pracy.

Poniższa demonstracja obejmuje następujące etapy: izolację PBMC, separację limfocytów T CD4+, hodowlę ekspansji in vitro oraz wizualizację limfocytów T za pomocą TEM lub barwienia. Krok pierwszy: izolacja PBMC.

Pobierz próbkę krwi. Krew należy zebrać do strzykawek lub probówek do krwi i przeciwukrzepić heparyną w stosunku 1:50, aby zapobiec krzepnięciu; spodziewana wydajność to około 1 milion PBMC na mililitr krwi. Około 40% z nich będzie stanowić limfocyty T CD4+.

Rozdziel krew do stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Do każdej probówki należy wlać 25 ml krwi. Przed krzepnięciem delikatnie wymieszaj krew, aby równomiernie rozprowadzić osocze.

Dodać PBS, aby uzyskać objętość całkowitą 40 mililitrów, a następnie utworzyć warstwę dolną, odsysając 11 mililitrów do fiolki, wkładając ją do probówki z krwią i ostrożnie zdejmując kontroler pipety z pipety. Zawartość fiolki powoli spłynie na dno probówki. Po wyrównaniu poziomów cieczy powoli wyjąć pipetę z probówki z krwią, zakręcić probówki i przenieść je do pojemników z aerozolem.

Mocno zakręć kanistry i wiruj z prędkością 900 ×g przez 20 minut bez hamowania. Jest to krytyczne, aby na koniec tego cyklu nie stosować hamowania, ponieważ siła hamowania zakłóci warstwę komórek po wirowaniu. PBMC powinny utworzyć wyraźną białą warstwę pomiędzy żółtą plazmą powyżej a przezroczystym osadem poniżej.

Ostrożnie zbierz warstwę białych krwinek za pomocą pipety transferowej i przenieś ją do nowej probówki. Wraz z PBMC może zostać pobrana niewielka ilość osocza i fibryny, jednak należy unikać pobrania jakiejkolwiek części warstwy czerwonych krwinek. Na tym etapie zazwyczaj można połączyć zawartość dwóch probówek z krwią w jednej probówce z komórkami.

Aby zwiększyć rozmiar osadu, należy dodać PBS, tak aby całkowita objętość wyniosła 15 milliliters, a następnie wirować z prędkością 500 times G przez 15 minutes z ustawieniem low break; odessać ciecz za pomocą pipety Pasteur, uważając, aby nie naruszyć osadu. Przetraktować buforem hemolitycznym, dodając od pięciu do sześciu milliliters do każdej probówki i delikatnie mieszając w celu usunięcia grudek. Inkubować nie dłużej niż pięć minut.

Dodać PBS, tak aby całkowita objętość wyniosła 50 milliliters, a następnie wirować z przyspieszeniem 230 ×g przez 10 minut. Przy niskim hamowaniu podczas tych wolniejszych wirowań nie są już wymagane nakładki przeciwaerozolowe. Przepłukać dwukrotnie, odsysając ciecz za pomocą pipety Pasteura i napełniając probówkę PBS, a następnie wirować z przyspieszeniem 230 ×g przez 10 minut przed końcowym etapem płukania; pobrać alikwot resuspenderowanych komórek, rozcieńczyć błękitem trypanowym i policzyć za pomocą hemosytometru.

Liczba komórek ta określi objętości odczynników wykorzystanych podczas separacji limfocytów T. Krok drugi, separacja limfocytów T CD4+, odessać ciecz i dodać bufor roboczy, aby doprowadzić całkowitą objętość do 40 µL na 10 milionów komórek. Zazwyczaj wymaga to dodania 30 µL buforu do pozostałej objętości osadu.

Przenieś tę objętość do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj koktajl przeciwciał z zestawów do izolacji CD4 w ilości 10 µL na 10 milionów komórek, zakręć probówkę i pozostaw na lodzie na 10 minut. Wyjmij probówkę z lodu, zdejmij zakrętkę i dodaj 30 µL buforu do elektroforezy na 10 milionów komórek.

Dodać kulki magnetyczne z zestawu do izolacji CD4 w ilości 20 µL na 10 milionów komórek, zakręcić probówkę i pozostawić na lodzie przez 15 minut. Dodać 10 objętości buforu do prowadzenia w celu przemycia, a następnie odwirować z prędkością 230 ×g przez 10 minut.

Podczas wirowania przygotuj w miejscu pracy magnes oraz probówkę polipropylenową o pojemności pięciu mililitrów. Odessaj ciecz znad osadu komórkowego. Dodaj dwa mililitry buforu roboczego i usuń grudki za pomocą pipety transferowej.

Za pomocą tej samej pipety transferowej przenieś komórki do probówki o pojemności 5 ml i inkubuj w magnesie przez 15 minut. Ostrożnie przelej frakcję limfocytów T CD4+ do oznakowanej probówki 15 ml, odwracając magnes i wylewając całą zawartość z wyjątkiem ostatniej kropli. Do probówki o pojemności 5 ml dodaj kolejne 2 ml buforu płuczącego i wyjmij ją z magnesu.

Delikatnie wypłucz cztery komórki negatywne CD z boków probówki i przenieś je do oznakowanej probówki 15 ml. Do każdej probówki dodaj dwa mililitry pożywki dla limfocytów T. Pobierz alikwoty do zliczenia komórek i wiruj przy 230 ×g przez 10 minut.

Rozcieńczyć alikwoty komórek barwnikiem trypan blue i policzyć je za pomocą hemocytometru. Uzyskana liczba komórek określi liczbę dołków wykorzystanych do hodowli ekspansyjnej. Krok trzeci.

W hodowli ekspansyjnej in vitro odessać ciecz nadsadczkę z osadów komórek CD4+ oraz CD4- w zależności od liczby komórek. Dodać medium do komórek CD4+, aby dostosować objętość do stężenia 3 milionów komórek/ml. Dodać medium do komórek CD4-, aby dostosować objętość do stężenia 10 milionów komórek/ml.

Kultura ekspansyjna wymaga 3 milionów komórek CD4 negatywnych oraz od 2 do 3 milionów komórek CD4 pozytywnych na każdą studzienkę. Zazwyczaj komórki CD4 pozytywne stanowią populację ograniczającą. Odmień komórki CD4 negatywne do odpowiedniej liczby studzienek na płytce 48-dołkowej.

Po dodaniu 300 µL do każdej studni, należy umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na jedną godzinę. Następnie należy wyjąć płytkę z inkubatora i wypłukać studnie, dodając 500 µL świeżego medium, delikatnie pipetując go w górę i w dół od 12 do 20 razy za pomocą pipety transferowej, a następnie usuwając cały płyn. To płukanie pozostawi warstwę przylegających komórek prezentujących antygen.

Po zakończeniu płukania należy dodać taką ilość pożywki, aby zwilżyć dno każdego dołka, mniej więcej 100 µL. W przeciwnym razie przylegające komórki wyschną. Jeśli jest to konieczne, należy dodać do każdego dołka od 2 do 3 milionów komórek CD4+.

Dodać dodatkowe pożywkę, aby zwiększyć całkowitą objętość w każdej studzience do 1 ml. Do każdej studzience dodać wybrany peptyd. Typowe stężenie stosowane do stymulacji wynosi 10 µg/ml.

Na koniec płytkę należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na siedem dni. Po siedmiu dniach należy dodawać 50 µL hemo IL 2 do każdej studni każdego kolejnego dnia.

Monitoruj wzrost komórek za pomocą mikroskopu. W studzienkach, w których nie osiągnięto jeszcze konfluencji, usuń połowę medium, a następnie dodaj świeże medium oraz 50 µL IL-2. W przypadku studzienek konfluentnych wykonaj pasaż komórek poprzez ich resuspensję i przeniesienie połowy zawiesiny do pustej studzienki. Dodaj świeże medium oraz 50 µL IL-2, a następnie umieść komórki z powrotem w inkubatorze. Namnażające się komórki będą gotowe do barwienia TEER po 13 do 15 dniach hodowli.

Krok czwarty, wizualizacja limfocytów T za pomocą barwienia tetramerami; należy zakupić lub złożyć tetramery dopasowane do peptydów i kombinacji MHC użytych do stymulacji limfocytów T CD4+. Wyjmij płytkę z inkubatora.

Ostrożnie odessać połowę pożywki z każdej studni. Alikwot komórek z każdej studni, zazwyczaj 75 µL lub około 50 000 komórek, przenieść do polistyrenowej probówki typu FACS o pojemności 5 mL, dodać teer, zazwyczaj 1 µL na 50 µL całkowitej objętości, i inkubować w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Zaleca się również barwienie drugiej alikwoty z każdej studni niedopasowanym teerem jako kontrolą negatywną. Komórki znakować przeciwciałami anty-CD3, anty-CD4 oraz anty-CD25.

Można zastosować dodatkowe lub alternatywne markery przeciwciał. Należy jednak unikać stosowania przeciwciał znakowanych PE, ponieważ ten kanał musi pozostać w tym momencie zarezerwowany dla teems. Ponadto, wszelkie kontrole jednobarwne lub izotypowe należy znakować przy użyciu dodatkowych komórek.

Inkubować komórki znakowane przeciwciałami przez 15 do 30 minut w temperaturze 4°C. Przemyć każdą probówkę od 0,5 do 1 mL buforu płuczącego i odwirować przy 230 ×g przez 10 minut. Ostrożnie odlać ciecz z probówek FACS, skalibrować cytometr przepływowy przy użyciu kulek referencyjnych, probówek kontrolnych dla pojedynczych barwień, kontroli izotypowych i tak dalej.

Przeanalizuj każdą probówkę przy użyciu cytometru przepływowego. Komórki tetra-dodatnie powinny stanowić wyraźną populację wśród namnożonych limfocytów T CD4-dodatnich. Komórki tetra-dodatnie są zazwyczaj CD25-dodatnie i często wykazują wysoką ekspresję CD4.