Ilościowa ocena lipidomu drożdży z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją elektrorsprayową

Niniejszy protokół umożliwia szybką analizę głównych składników lipidów drożdżowych. Procedurę rozpoczyna się od zebrania i przemycia komórek drożdży. Przemyte komórki umieszcza się w mieszaninie chloroformu i metanolu w stosunku od 1:1 do 2:1, a następnie poddaje lizie za pomocą szklanych kulek.

Dodanie chloroformu i wody powoduje rozdzielenie obu faz. Fazę organiczną zbiera się i osusza, a następnie film lipidowy rozpuszcza w chloroformie w celu przechowywania przed spektrometrią mas. Ekstrahowane lipidy rozcieńcza się w chloroformie i metanolu z wodorotlenkiem amonu, po czym dodaje mieszaninę standardów wewnętrznych.

Roztwór lipidów można teraz wstrzyknąć bezpośrednio do spektrometru mas. Cześć, jestem Simon Bork z laboratorium Vladimira Teco w Departamencie Biologii Uniwersytetu Concordia. Dzisiaj zaprezentuję metodę ilościowego oznaczania lipidów drożdżowych przy użyciu spektrometrii mas.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania zmian w lipidach drożdży w różnych warunkach wzrostu. Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, resuspenduj wcześniej przygotowane mrożone pellety drożdży w 1,6 mililitrów lodowatej wody destylowanej, a następnie przenieś 1,6 mililitrów zawiesiny komórkowej do szklanych probówek do wirówki wysokich obrotów.

Należy pamiętać, że w całej tej procedurze wszystkie manipulacje z wyekstrahowanymi lipidami wykonuje się przy użyciu szklanych pipet lub strzykawek. Ponieważ tworzywa sztuczne generują silny sygnał tła w kontakcie z chloroformem, ekstrakcję lipidów należy rozpocząć od dodania do zawiesiny komórkowej sześciu mililitrów mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku jeden do dwóch oraz 0,8 mililitrów kulek szklanych odmierzonych w probówce typu einor. Dokładne objętości nie są krytyczne, o ile zachowany zostanie stosunek jeden do dwóch do 0,8 dla chloroformu, metanolu i drożdży zawieszonych w wodzie. Wymieszać w wstrząsaciu typu vortex.

Zawiesinę komórkową z kuleczkami szklanymi miesza się dwukrotnie po jednej minucie, następnie dodaje dwa mililitry chloroformu, miesza delikatnie i inkubuje przez pięć minut w temperaturze pokojowej, sporadycznie mieszając. Po pięciu minutach inkubacji dodaje dwa mililitry wody destylowanej i miesza delikatnie. Następnie ponownie inkubuje przez pięć minut w temperaturze pokojowej, sporadycznie mieszając.

Tutaj również ważniejsze od konkretnej objętości jest zachowanie stosunku 2:2:1.8 dla chloroformu, metanolu i wody. Po zakończeniu drugiej inkubacji odwirować próbkę przez pięć minut przy 3000 Gs w temperaturze pokojowej, zebrać cały nadsącz z tej pierwszej ekstrakcji do nowej szklanej probówki do wirowania wysokich prędkości i dodać 3,2 ml chloroformu do pozostałego osadu komórkowego w celu przeprowadzenia drugiej ekstrakcji lipidów.

Osady komórkowe z dodanym chloroformem mieszaj w wibratorze typu vortex dwa razy po jednej minucie. Następnie wiruj przez pięć minut przy 3000 Gs. W temperaturze pokojowej dodaj nadsącz z tej drugiej ekstrakcji do nadsączu zebranego po pierwszej ekstrakcji. Następnie wiruj zebrane nadsącze przez pięć minut.

Po wirowaniu z prędkością 3000 Gs w temperaturze pokojowej wyekstrahowane lipidy znajdują się teraz w dolnej fazie organicznej. Odrzuć górną fazę wodną i przelej dolną fazę do nowej szklanej probówki do wirowania wysokiego. Aby uzyskać czystsze widma w spektrometrze mas, wiruj fazę organiczną przez pięć minut z prędkością 3000 Gs w temperaturze pokojowej, a następnie przelej cały supernatant do szklanej fiolki.

Wysuszyć rozpuszczone lipidy w strumieniu azotu, rozpuścić wysuszoną warstwę lipidową w 500 µL chloroformu i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy próbek metodą spektrometrii mas. Rozpocząć od przygotowania mieszaniny wzorcowej lipidów w chloroformie, zgodnie z listą zamieszczoną w tabeli 1 w załączonym protokole pisemnym. Każdy lipid reprezentuje inną klasę.

Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania przed wstrzyknięciem wyekstrahowanych lipidów do spektrometru mas. Połączono 10 µL próbki z 10 µL mieszaniny standardów lipidowych. Należy pamiętać, że stosunek standardu do próbki można zmienić w zależności od potrzeb.

Rozdziel mieszaninę lipidów z próbek i standardów za pomocą spektrometru mas Q-TOF, wyposażonego w źródło nano-elektrospray pracujące przy szybkości przepływu 1 µL/min. Ustawienia szczegółowo opisano w tabeli 2 dołączonego protokołu pisemnego. Choć wysoka rozdzielczość spektrometru mas Q-TOF jest korzystna, nie jest ona wymogiem obligatoryjnym.

Dokładne parametry instrumentu będą się różnić w zależności od spektrometru mas. Po akwizycji danych widma mas są wygładzane, odejmowane jest tło, a piki są centrowane. Na koniec należy wyeksportować listę pików do programu Excel.

Następnie należy znormalizować piki każdego szkła lipidowego względem ich standardu wewnętrznego. W zależności od zastosowania może być konieczne przeprowadzenie dalszej obróbki, takiej jak usunięcie izotopów oraz dekonwolucja. Metoda ta pozwala na szybkie i szczegółowe oznaczenie głównych składników lipidomu drożdży.

Tutaj wyróżniliśmy jeden lipid, który został poddany dekonwolucji izotopowej i znormalizowany względem wzorca wewnętrznego. Przedstawiliśmy właśnie sposób izolacji lipidów drożdżowych oraz metodę ich oznaczania z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją elektrorzutową. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o unikaniu stosowania tworzyw sztucznych oraz utrzymywaniu stężenia próbki w zakresie liniowym.

Metoda ta jest dość elastyczna i w wielu przypadkach objętości mogą być zmieniane według potrzeb. Niniejszy protokół ekstrakcji nadaje się również do innych metod analizy lipidów, takich jak chromatografia cienkowarstwowa oraz wielowymiarowa spektrometria mas. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.