Ilościowe oznaczanie białek z wykorzystaniem immunoafinityjnego wzbogacania peptydów sprzężonego ze spektrometrią mas

Ogólnym celem poniższej procedury jest wyizolowanie i ilościowe oznaczenie peptydów w złożonej mieszaninie, które służą jako zamienniki dla ich odpowiednich białek. W pierwszej kolejności duże białka w mieszaninie są trawione do peptydów składowych przy użyciu enzymu, takiego jak trypsyna. Następnie docelowe anality peptydowe oraz dodany standard wewnętrzny znakowany stabilnymi izotopami są wzbogacane przy użyciu przeciwciał antypeptydowych unieruchomionych na magnetycznych cząstkach znakowanych białkiem G po izolacji.

Docelowe peptydy są wymywane z cząsteczek magnetycznych i analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu ich oilościowego oznaczenia w stosunku do standardu wewnętrznego. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjne testy immunoenzymatyczne, są większa szybkość oraz niższy koszt opracowania dużej liczby testów. Metoda ta charakteryzuje się wysoką skutecznością i łatwością w prowadzeniu analiz wieloparametrowych (multipleksowaniu), co zostanie przedstawione w poniższej procedurze.

Technik laboratoryjny pobrał 10 µL plazmy na kruszonym lodzie. Przeniesiono próbkę do płytki głębokoodworowej o pojemności 1000 µL i przykryto folią Parafilm, aby zdenaturować białka. Do każdej próbki dodano 20 µL świeżego 9 M mocznika oraz 30 mM DTT, a następnie inkubowano przez 30 minut w 37 °C. Następnie do każdej próbki dodano 3 µL świeżego 500 mM jodoacetamidu i inkubowano przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Następnie rozcieńczono mocznik do stężenia 0,6 M za pomocą 100 mM TRIS o pH 8 i dodano 10 µL roztworu stokowego trypsyny o stężeniu 1 µg/µL, aby uzyskać stosunek enzymu do substratu 1:50.

Po inkubowaniu reakcji w temperaturze 37°C przez noc z dodatkiem 3 µL czystego kwasu mrawkowego do końcowego stężenia 1%, należy dodać stabilny standard izotopowy lub kilka standardów. W przypadku przeprowadzania analizy multipleksowej płytkę z kartridżami Oasis należy dokładnie przemyć 500 µL 0,1% kwasu mrawkowego w 80% acetonitrylu, odrzucając przesącz. Następnie należy przeprowadzić równoważenie płytki z kartridżami, dodając 500 µL 0,1% kwasu mrawkowego w wodzie i odrzucając przesącz.

Nanieś próbki po trawieniu na płytkę z wkładami i dostosuj próżnię tak, aby przepływ był bardzo powolny. Przemyj trzy razy 500 µL 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie i odrzuć filtrat. Eluuj peptydy dwukrotnie 500 µL 0,1% kwasu mrówkowego w 80% acetonitrylu, a następnie liofilizuj lub odparuj eluat do suchości i zrekonstytuuj wysuszone peptydy w 50 µL PBS z dodatkiem 0,03% Chaps. Przenieś próbki do standardowej płytki Kingfisher 96-dołkowej; dodaj 1 µg przeciwciała oraz 1,5 µL magnetycznych kulek pokrytych białkiem G na każdy cel. Przed dodaniem wymieszaj kulki w wstrząsarze vórteksowym.

Aby zapewnić odpowiednie zawieszenie kulek, należy przykryć płytkę folią i inkubować przez noc w wirówce obrotowej przy łagodnym mieszaniu. Płytkę należy wirować z prędkością 400 RPM przez 10 sekund, aby usunąć ciecz z powierzchni folii.

Zdejmij pokrywę z folii. Manipulacja próbkami odbywa się na zautomatyzowanej platformie Kingfisher. Przemyj kuleczki dwukrotnie 200 µL PBS z dodatkiem 0,03% CHAPS, a następnie raz 200 µL roztworu PBS z dodatkiem 0,03% CHAPS w rozcieńczeniu 1:10. Następnie eluj peptydy za pomocą 25 µL 5% kwasu octowego z dodatkiem 0,03% CHAPS.

Umieść płytkę do elucji na magnesie i przenieś eluat do płytki 96-dołkowej, dbając o to, aby nie przenieść pozostałych kulek. Przykryj płytkę matą uszczelniającą, a następnie wprowadź tę płytkę zawierającą eluat do potrójnego lub poczwórnego spektrometru mas w celu przeprowadzenia analizy. Metoda MRM jest opracowywana poprzez uzyskanie tandemowego widma masowego interesującego peptydu, a następnie wybór i optymalizację najlepszych jonów fragmentów przejścia.

Zazwyczaj konfiguracja do analizy MRM wykorzystuje kolumnę pułapkującą C 18 oraz kolumny analityczne z dwiema fazami ruchomymi. Należy nałożyć 10 µL próbki i przeprowadzić elucję za pomocą gradientu liniowego. Następnie należy zintegrować powierzchnie pików dla peptydów lekkich i ciężkich oraz obliczyć stosunek powierzchni piku peptydu nieznakowanego do znakowanego w każdej próbce.

Peptydy lekkie i ciężkie eluują w tym samym czasie, a dla każdego peptydu można monitorować wiele przejść. Aby potwierdzić tożsamość, powierzchnię piku peptydy endogennego mierzy się w stosunku do powierzchni standardu wewnętrznego, co pozwala na ilościowe oznaczenie docelowego peptydu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wdrożyć tę technikę w swoim laboratorium. Może ona służyć do kwantyfikacji każdego białka zainteresowania, co czyni ją odpowiednią dla szerokiego zakresu zastosowań w badaniach biologicznych.