Generowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu ludzkich lentiwirusów TF firmy Stemgent

Witajcie, nazywam się Brad Hamilton. Jestem naukowcem w dziale badawczno-rozwojowym w STEM Gen. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę reprogramowania ludzkich fibroblastów przy użyciu czynników reprogramujących dostarczanych za pomocą lentiwirusów.

Niniejszą procedurę można wykorzystać zarówno do generowania komórek IPS, jak i do badania procesu przeprogramowania. Komórki IPS są podobne do komórek ES pod względem morfologii, proliferacji oraz zdolności do różnicowania się we wszystkie typy tkanek organizmu. Ludzkie komórki IPS mają wyraźną przewagę nad komórkami ES, ponieważ wykazują kluczowe właściwości komórek ES, nie wiążąc się z dylematem etycznym dotyczącym niszczenia zarodka w celu ich pozyskania.

Generowanie specyficznych dla pacjenta komórek iPS pozwala ominąć istotną przeszkodę w spersonalizowanych terapiach medycyny regeneracyjnej, eliminując ryzyko odrzucenia immunologicznego nieautologicznych przeszczepionych komórek. Zacznijmy zatem. W kilku momentach tego protokołu należy wymienić medium hodowlane rozwijających się iPSC, czyli indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych, na medium warunkowane.

Przygotowanie tego medium trwa sześć dni. Należy zatem zacząć co najmniej tydzień przed planowanym rozpoczęciem eksperymentu. Aby zacząć, wysiej w każdej studzience sześciostudzienkowej.

Płytka wielodołkowa zawierająca 2 × 10⁵ jtk komórek zasilających meth w 2 mL pożywki wzrostowej meth; inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO₂. Następnego dnia wymienić pożywkę na pożywkę do hodowli komórek ludzkich E-S-I-P-S.

Pożywkę inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Zbierać supernatant i wymieniać na świeżą pożywkę co 24 godziny przez cztery dni. Przefiltrować supernatant przez filtr o rozmiarze porów 0,22 µm.

Uzupełnij zebrany nadsącz, dodając 15 ng/ml BFGF (podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów). Otrzymasz około 16 ml pożywki warunkowanej przez komórki Meth; przechowuj nadsącz zebrany każdego dnia oddzielnie w temperaturze 4°C. Pożywka warunkowana przez komórki Meth może być przechowywana od jednego do dwóch tygodni w temperaturze 4°C lub przez kilka miesięcy w temperaturze -20°C.

Po upewnieniu się, że medium warunkowane metylatorem będzie gotowe w odpowiednim momencie, omówmy przygotowanie komórek. Pierwszym zadaniem w generowaniu iPSC jest wykorzystanie lentiwirusów do transdukcji ludzkich fibroblastów z napletka, czyli komórek BJ, czterema czynnikami transkrypcyjnymi charakterystycznymi dla komórek macierzystych. Aby przygotować się do transdukcji, należy wysiać komórki BJ z gęstością 1 × 10⁵ komórek na dołek w płytce 6-dołkowej i poddać je hodowli.

Komórki w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej inkubowano przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w tym samym dniu. Przygotowanie płytek z komórkami karmicielkami rozpoczęto od dodania dwóch mililitrów 0,1% żelatyny rozcieńczonej w wodzie do płytki 6-dołkowej i inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Żelatyna pokrywa dołki i służy jako macierz dla komórek.

Komórki BJ są teraz gotowe do transdukcji lentiwirusowej w celu przygotowania wirusa do transdukcji. Do dwóch mililitrów świeżej pożywki dodać sześć mikrogramów na mililitr polybrene oraz cztery lentiwirusy, z których każdy koduje jeden z ludzkich czynników transkrypcyjnych: T4, SO2, nanog oraz lin 28, w taki sposób, aby każdy z nich był w tej samej wielokrotności infekcji (MOI).

Wszystkie te lentiwirusy wchodzą w skład zestawu lentiwirusów z czynnikami reprogramującymi człowieka. Aby przeprowadzić transdukcję, należy po prostu zastąpić pożywkę do hodowli komórek BJ pożywką zawierającą wirusy. Delikatnie zakołysać płytkę, aby pożywka równomiernie pokryła jej dno.

Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide tego samego dnia. Wyjąć jedną fiolkę komórek feeder cf one meth z ciekłego azotu i rozmrozić. Usunąć roztwór żelatyny z płytek z komórkami feeder meth, które są teraz każda pokryta żelatyną.

Dodaj 0,2 × 10⁵ komórek do 2 ml medium wzrostowego BJ. Inkubuj medium przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnego dnia odłącz komórki BJ za pomocą 0,05% trypsyny-EDTA i odwiruj przy 200 ×g przez 5 minut.

Po wirowaniu odessać supernatant i resuspender komórki w pożywce wzrostowej. Usunąć pożywkę z płytki z komórkami karmidłowymi METH i dodać do każdej studni dwa mililitry zawiesiny komórek BJ. Stężenie komórek BJ powinno wynosić około 5 × 10⁴ komórek na studnię.

Inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO₂. 24 godziny po wysianiu komórek BJ na płytkę z warstwą karmąca (feeder plate) wymienić medium na human E-S-I-P-S (medium do hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych). Kontynuować wymianę medium co 24 godziny przez siedem dni.

Siódmego dnia należy zastąpić pożywkę do hodowli komórek ES dwoma mililitrami pożywki kondycjonowanej przez komórki meth. Komórki karmicielskie meth dostarczały rozpuszczalnych czynników niezbędnych do wzrostu komórek IPS. Obecnie należy jednak dodać więcej tych czynników, aby utrzymać hodowlę w dobrym stanie.

Pożywka warunkująca Meth zawiera wszystkie rozpuszczalne czynniki wydzielane przez komórki feeder Meth inkubowane przez noc w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Patrząc przez okular mikroskopu, wybierz kolonię komórek. Rozpoznawana po niewielkim, zwartym, kopulastym wyglądzie w świeżej płytce 24-dołkowej, którą 24 godziny wcześniej obsiano komórkami feeder ccf one meth; wyizoluj wybraną kolonię w hodowli ludzkich E-S-I-P-S.

Pożywka uzupełniona o 10 µM cząsteczki macierzystej Y 2 7 6 3 2, która jest inhibitorem zależnej kinazy. Przez pierwsze siedem dni wymieniać pożywkę hodowlaną co 24 godziny, nie dodając cząsteczki macierzystej Y 2 7 6 3 2.

Po siedmiu dniach należy zmienić pożywkę na pożywkę z dodatkiem metylu. Kontynuuj pasażowanie komórek w tej pożywce, aż wykażą one typową morfologię ludzkich komórek ES. Poszukuj małych, zwartych kolonii w kształcie kopułek o ostrych krawędziach.

Kolonie powinny być jednorodne i charakteryzować się wysokim stosunkiem jądra do cytoplazmy. Na tym etapie uzyskano kolonie o morfologii komórek ES, ale czy wykazują one również ekspresję genów charakterystycznych dla komórek ES? Aby to sprawdzić, należy przeprowadzić barwienie kolonii na markery pluripotencji, takie jak TRA 180, TRA 1 60, SSEA 4, SSEA 3, T 4, sox 2, nanog oraz SSEA 1. W celu rozpoczęcia procedury należy delikatnie przemyć komórki trzykrotnie przy użyciu PBS.

Następnie utrwal komórki, dodając 500 µL 4% paraformaldehydu lub innego utrwalacza, i inkubując przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po 20 minutach przemyj komórki trzykrotnie buforem PBS, aby usunąć nadmiar utrwalacza. Następnie zablokuj niespecyficzne wiązanie, inkubując komórki w 500 µL buforu blokującego na każdą studzinkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po etapie blokowania dodaj do każdej studzinki 250 µL przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w buforze blokującym w stosunku 1:100.

Następnie komórki inkubuje się z przeciwciałem pierwotnym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia komórki przemywa się trzykrotnie roztworem PBS, aby usunąć niezwiązane przeciwciało pierwotne. Komórki inkubuje się przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej z 250 µL przeciwciała wtórnego w rozcieńczeniu 1:300 w buforze blokującym, chroniąc próbki przed światłem, aby uniknąć fotobielenia po inkubacji z przeciwciałem wtórnym.

Przemyj komórki trzykrotnie PBS-em aż do trzeciego płukania. Dodaj DPI w stężeniu 1 µg/mL w celu zabarwienia jąder komórkowych. Na koniec przeanalizuj ekspresję genów w swoich komórkach IPS.

Wyniki morfologiczne pod mikroskopem ludzkich fibroblastów skóry, które zostały współprzetransdukowane czynnikami Oct4, Sox2, Nanog i Lin28. Zmiany morfologiczne zaobserwowano już w czwartym dniu po transdukcji, a skupiska komórek stały się bardziej zwarte w 17. dniu. Ekspresja markerów pluripotencji. Aby dalej scharakteryzować wyizolowane kolonie iPS, zbadano obecność wspólnych markerów pluripotencji eksprymowanych w komórkach ES. Kolonie wykazały silną aktywność fosfatazy alkalicznej.

Dodatkowo, w koloniach komórek IPS przeprowadzono analizę immunochemiczną lub ICC z zastosowaniem panelu przeciwciał specyficznych dla markerów pluripotencji, obejmującego markery powierzchniowe TA 180 1 TRA one 60 SSEA four i SS EEA three, a także markery jądrowe: T four, SOX two i Nanog. Izolowane kolonie IPS były dodatnie w odniesieniu do wszystkich markerów. Wyniki ICC wykazują, że komórki IPS prezentowały odpowiedni wzorzec ekspresji markerów pluripotencji, co dowodzi, że komórki IPS te ściśle przypominają niezdiferencjowane ludzkie komórki E es.

Właśnie pokazaliśmy, jak generować komórki iPS poprzez reprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą genów macierzystych. Zestaw lentiwirusowy czynników reprogramujących człowieka. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest uwzględnienie kilku czynników.

Po pierwsze, stosunek aktywnego wirusa do komórek docelowych może wymagać modyfikacji podczas głównego etapu transdukcji w celu osiągnięcia optymalnej wydajności transdukcji. Po drugie, wpływ mogą mieć warunki hodowli komórek docelowych. Zdrowe i proliferujące komórki są bardziej podatne na przeprogramowanie.

Po trzecie, przy modyfikowaniu protokołu dla różnych liczb komórek zaleca się, aby docelowa liczba komórek była dostosowana proporcjonalnie do powierzchni płytki hodowlanej. Na koniec, w celu zapewnienia pomyślnego przeprogramowania, należy rozważyć zastosowanie inhibitorów ROCK, takich jak Y 2 7 6 3 2, ponieważ niedawne badania wykazały ich skuteczność w zwiększaniu przeżywalności kolonii ludzkich iPS. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.