Reprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wygenerowanie ludzkich komórek iPS poprzez retrosygnacyjną nadekspresję OCT4, SOX2, KLF4 i c-MYC z zastosowaniem systemu reporterowego GFP. Jest to osiągane poprzez uprzednie dodanie odpowiedniej ilości poszczególnych retrowirusów wykazujących ekspresję GFP. Następnie zainfekowane wirusem z ekspresją GFP komórki przenosi się na płytki powlekane 0,1% żelatyną z fibroblastami embrionalnymi myszy.

Trzecim krokiem procedury jest wymiana medium na pożywkę do hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Na koniec izoluje się kolonie iPS z wyciszonym GFP, które wykazują morfologię podobną do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Ostatecznie wyniki wykazują ekspresję endogennych markerów pluripotencji za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i R-T-Q-P-C-R.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak barwienie żywych komórek z zastosowaniem pluripotencjalnych markerów powierzchniowych i obserwacja zmian morfologicznych, jest pożądany iPad. Kolonie komórek można łatwo wyizolować, wykorzystując utratę ekspresji GFP jako marker komórek pluripotencjalnych w celu rozpoczęcia hodowli. Na jeden dzień przed infekcją wysiać ludzkie fibroblasty w medium do fibroblastów w ilości 1×10⁵ ludzkich fibroblastów do jednego dołka płytki 6-dołkowej. Następnego dnia odessać medium, aby usunąć martwe komórki, i dodać 2 ml świeżego medium do fibroblastów z dodatkiem 5 µg/ml siarczanu protaminy.

Następnie ostrożnie dodaj odpowiednią ilość każdego wirusa wykazującego ekspresję GFP, odpowiadającą wielokrotności zakażenia (MOI) równej pięciu. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez noc, jeden dzień po zakażeniu. Usuń nadsącz wirusowy i przemyj trzy razy 2 mL PBS.

Następnie, trzy dni po infekcji, należy dodać dwa mililitry pożywki dla fibroblastów. Sprawdzono fluorescencję GFP i uzupełniono studzienkę o dwa mililitry pożywki dla fibroblastów. Następnego dnia na 10-centymetrową szalkę Petriego pokrytą 0,1% żelatyny wysiano w pożywce dla fibroblastów 1 × 10⁴ na centymetr kwadratowy naświetlonych embrionalnych fibroblastów mysich lub komórek feeder MEF.

Inkubować komórki w temperaturze 37°C przez noc. Następnego dnia odkleić zakażone ludzkie fibroblasty, dodając 1 ml 0,05% trypsyny EDTA, i inkubować przez pięć minut w temperaturze 37°C, a następnie wirować przez pięć minut przy 200 G. Resuspender komórki w 10 ml pożywki dla fibroblastów i wysiać je ponownie na podłoże uprzednio pokryte 0,1% żelatyną z mfs. Powtórzyć czynność po 24 godzinach.

Wymień pożywkę na pożywkę hodowlaną HESC i wymieniaj ją codziennie. Kolonie przypominające ESC zaczną pojawiać się od 20 do 27 dni po infekcji; weryfikuj ich obecność pod mikroskopem fluorescencyjnym. Sprawdź brak fluorescencji GFP w kolonii wykazującej morfologię podobną do HSC.

Używając pipety 10 µL, pobierz poszczególne kolonie iPSC i przenieś je do pojedynczych dołków 12-dołkowej płytki powlekanej żelatyną i metoksylopectiną, uzupełnionej pożywką HESC. Wymieniaj pożywkę codziennie; pasażuj komórki, przemywając płytkę 1 mL pożywki DMM F 12.

Następnie dodaj 0,5 ml kolagenazy i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Przemyj komórki dwukrotnie za pomocą DM A MF 12. Następnie dodaj dwa mililitry świeżej pożywki HESC.

Następnie za pomocą scrapra (cell lifter) rozbić kolonie na małe fragmenty i odczepić pozostałe komórki od płytki. Przenieść resuspensowane fragmenty kolonii do jednego dołka sześciodołkowej płytki pokrytej żelatyną i MEF, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez dwa dni.

W celu sprawdzenia komórek metodą immunofluorescencji, należy przemyć je trzykrotnie PBS i utrwalić 4% paraldehydem przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie komórki należy delikatnie przemyć trzykrotnie PBS i poddać permeabilizacji 0,2% Triton X 100 w PBS przez 30 minut.

Zablokuj niespecyficzne wiązanie, inkubując komórki w 3% BSA w PBS przez dwie godziny. Następnie inkubuj komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Potem przemyj komórki trzykrotnie PBS i inkubuj je z przeciwciałem drugorzędowym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, w ciemności.

Przemyj komórki trzy razy buforem PBS, kończąc na ostatnim płukaniu. Dodaj dappy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Wykonaj obrazowanie komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu przeprowadzenia ilościowej analizy w czasie rzeczywistym.

Wyizoluj całkowite RNA z ludzkich IPC pochodzących z fibroblastów ludzkich za pomocą zestawu do izolacji RNA. Zsyntetyzuj pierwszą nici cDNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy.

Następnie należy wykorzystać go jako matrycę do qPCR w celu wykrycia genów pluripotencji. Ludzkie fibroblasty BJ, które zostały zainfekowane koktajlem retrowirusów niosących OCT4, SOX2, KLF4 i MYC, wykazują przedstawione tutaj zmiany morfologiczne obserwowane podczas reprogramowania od piątego dnia. W dniach 10, 14 i 21 komórki zaczynają wykazywać morfologię przypominającą hESC, a po 21 dniach iPSC są rozpoznawane dzięki fluorescencji GFP.

Pluripotentne komórki macierzyste, takie jak ESC i IPC, wykazują aktywność mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za represję ekspresji genów prowirusowych. Jednakże zastosowane w tym badaniu wektory retrowirusowe wykazują ekspresję GFP wraz z genami reprogramującymi pod kontrolą retrowirusowego LTR. Zatem komórki stale wykazujące ekspresję GFP są uznawane za komórki z ekspresją transgenów bez wyciszania genów prowirusowych; jak tutaj rzetelnie pokazano, reprogramowane kolonie iPSC, które nabyły molekularną sieć pluripotencji, wykazują brak ekspresji GFP.

Rysunek ten przedstawia analizę immunohistochemiczną kolonii pochodzących z fibroblastów Detroit 5 51 z przeciwciałami przeciwko TRA 180 1, TRA one 60, SSEA four, T four oraz nano, co potwierdza sukces procesu. Przeprogramowane iPSC wykazują ekspresję wszystkich tych markerów. Ponadto przeprowadzono ilościową analizę R-T-P-C-R w celu zbadania ekspresji genów, która wykazała, że poziomy T four, SOX two, KLF four M oraz nano były znacząco zwiększone w porównaniu z macierzystymi komórkami fibroblastów, ale porównywalne z poziomami w H nine HSCs.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzić infekcję wirusem oraz jak zidentyfikować i wyizolować w pełni zaprogramowane lipidowo komórki IPA przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.