Wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych

W niniejszym artykule wideo przedstawiono przeprogramowanie ludzkich dojrzałych fibroblastów w celu uzyskania pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu wektorów retrowirusowych. W pierwszej kolejności fibroblasty ludzkie poddaje się transdukcji wektorami retrowirusowymi kodującymi czynniki transkrypcyjne: T three four, SOX two, KLF four oraz cmic.

Zainfekowane fibroblasty hoduje się na embrionalnych komórkach żerujących myszy przez okres od 14 do 28 dni. Powstałe kultury barwi się przeciwciałem TRA 180 1 w celu zidentyfikowania kolonii przeprogramowanych komórek. Pozytywne kolonie przenosi się następnie na płytki zawierające MEF w celu ich ekspansji.

Barwienie immunocytochemiczne potwierdza ekspresję markerów pluripotencji oraz ustanowienie linii pluripotencjalnych komórek macierzystych. Następnie należy przeprowadzić dodatkowe badania w celu dalszej charakterystyki tych linii. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z programowaniem komórek somatycznych i kulturami ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych napotykają trudności, ponieważ identyfikacja prawidłowych kolonii iPSC jest wymagająca.

Procedurę zaprezentuje dr Sula Pollak, post-doc z mojego laboratorium. Procedurę należy rozpocząć od wysiania komórek Phoenix AM FO z gęstością około 7 do 8 milionów komórek na płytkę 10 cm w 10 ml DMEM z wysoką zawartością glukozy; następnie płytki należy umieścić w inkubatorze i hodować przez noc. Następnego dnia należy przygotować mieszaniny do transfekcji składające się z 12 µg wektora kodującego gen T34SOX, 2KLF, 4CMIC lub GFP oraz 35 µl FuGENE 6 w całkowitej objętości 500 µl bezserwatkowego DMEM z wysoką zawartością glukozy i L-glutaminą.

Inkubuj mieszaniny przez 20 minut. Następnie, aby przeprowadzić transfekcję komórek phoenix, delikatnie pipetuj kompleksy DNA do płytek zawierających komórki phoenix, które powinny osiągnąć 70 do 80% konfluencji. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez sześć do ośmiu godzin.

Odssać pożywkę i zastąpić ją ośmioma mililitrami DMEM z wysoką zawartością glukozy i antybiotykami. Następnie umieścić płytki w inkubatorze na 12 godzin po inkubacji. Za pomocą pipety odessać i zebrać pożywkę zawierającą wirusa.

Następnie wymień pożywkę i powtarzaj ten proces co 12 godzin, aż do momentu czterokrotnego zebrania pożywki. Przechowuj pożywkę w temperaturze 4 °C. Po zebraniu całej pożywki połącz wszystkie porcje, a następnie przefiltruj ją przez filtr nakrętkowy o wielkości porów 0,45 µm do probówki stożkowej o pojemności 50 mL, aby usunąć oderwane komórki i zanieczyszczenia.

Przefiltrowane medium zawierające cząsteczki wirusa można przechowywać w lodówce przez dwa tygodnie bez utraty aktywności infekcyjnej. Zamrażanie nie jest zalecane. Dzień przed procedurą transdukcji należy rozmrozić zamrożony zapas ludzkich fibroblastów dorosłego człowieka i dodać 1 × 10⁵ komórek do każdego dołka sześciodołkowych płytek pokrytych żelatyną.

Następnego dnia w 50 mililitrowej probówce stożkowej połączyć po 3,5 mililitra T four SOX two, klf four oraz medium wirusowego cmic, a następnie dodać poly brain do końcowego stężenia 6 µg/L jako kontrolę. Przygotować 1 mililitr medium wirusowego GFP, 3 mililitry medium hodowlanego oraz poly brain w końcowym stężeniu 6 µg/mL. Odessać medium z płytki zawierającej ludzkie fibroblasty.

Następnie dodać 4 mL mieszanego medium wirusowego lub medium kontrolnego i wirować płytki z prędkością 1600 G przez jedną godzinę w temperaturze 20 °C. Po wirowaniu inkubować płytki przez około 12 godzin. Następnie zastąpić medium wirusowe medium do hodowli fibroblastów i inkubować przez kolejne 12 godzin.

Powtórz ten proces od momentu infekcji do hodowli w pożywce dla fibroblastów jeszcze dwa razy po ostatniej infekcji. Hoduj fibroblasty w DMEM przez 48 godzin. Następnie sprawdź wydajność infekcji równoległych transdukcji za pomocą pożywki retrowirusowej z GFP.

Następnie należy zainicjować reprogramowanie komórek somatycznych do pluripotencjalnych. Zainfekowane fibroblasty hoduje się w medium dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub medium HES. W kolejnym dniu wysiewa się embrionalne fibroblasty mysie lub MEF z gęstością około 2 × 10⁵ komórek na studzienkę w sześciostudzienkowej płytce potraktowanej żelatyną, w medium wzrostowym dla fibroblastów.

Przesiąć zainfekowane ludzkie fibroblasty, używając 0,05% trypsyny EDTA, i wysiać je z gęstością około 1,2 × 10⁴ na studzienkę w pożywce do wzrostu fibroblastów. Następnego dnia wymienić pożywkę na pożywkę HES zawierającą 0,5 mM maślanu sodu przez pierwsze siedem dni reprogramowania.

Wymieniaj pożywkę codziennie. Zastąp pożywkę pożywką HES bez maślanu sodu i kontynuuj reprogramowanie przez kolejne od 7 do 21 dni. Wymieniaj pożywkę każdego dnia.

Sprawdź transdukowane komórki pod kątem zmian morfologicznych. Kolonie komórek zaczną pojawiać się około 10 dni po przeniesieniu transdukowanych fibroblastów na komórki wspomagające. Kolonie zawierające przeprogramowane komórki są od tego momentu nazywane ludzkimi indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi lub ludzkimi komórkami iPS.

Kolonie ludzkich komórek iPS będą gotowe do izolacji od 14 do 28 dni po wysianiu ich na komórki zasilające MEF. Na tym etapie kolonie ludzkich komórek iPS można przenieść na płytki zawierające MEF lub płytki pokryte matrigelem. Przenoszenie na płytki zawierające MEF zostało zademonstrowane dzień przed pobraniem kolonii ludzkich komórek iPS. Wysiej płytki 24-dołkowe zawierające naświetlone promieniami gamma komórki zasilające MEF w pożywce do wzrostu fibroblastów.

Inkubować w temperaturze 37°C przy 5% CO2 w dniu, w którym będą pobierane kolonie ludzkich komórek iPS. Odessać pożywkę do wzrostu fibroblastów z ME Fs i wypłukać je za pomocą PBS, aby usunąć wszelkie ślady FBS. Następnie dodać 0,5 ml pożywki dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HES) zawierającej 10 µM inhibitora ROCK Y 2 7 6 3 2 do każdej studzienki; następnie, używając mikroskopu zamontowanego w komorze z laminarnym przepływem powietrza, sprawdzić płytki do reprogramowania pod kątem tworzenia się kolonii ludzkich komórek iPS.

W razie potrzeby usunąć fibroblasty otaczające kolonie ludzkich komórek IPS za pomocą igły 21G. Przepłukać płytki za pomocą PBS i dodać świeże medium HES zawierające specyficzne przeciwciało TRA 180 1 stain alive. Przenieść komórki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5%CO2.

Po 30 minutach należy wymienić pożywkę na świeżą pożywkę HES uzupełnioną o 10 µM inhibitora ROCK. Następnie należy obejrzeć kolonie pod mikroskopem fluorescencyjnym i zaznaczyć kolonie pozytywne pod kątem TRA-1-81.

Używając znacznika obiektywnego z igłą 21 G, podziel kolonie ludzkich komórek iPS TRA 180 1+ na kilka małych fragmentów. Następnie, za pomocą automatycznej pipety, przenieś fragmenty kolonii ludzkich komórek iPS do poszczególnych studni płytki 24-dołkowej z MEFami. Unikaj przenoszenia komórek innych niż iPS.

Umieść płytki w inkubatorze i pozostaw kolonie ludzkich komórek iPS na 24 do 36 godzin w celu ich przytwierdzenia, zmieniając pożywkę codziennie. Kolonie ludzkich komórek iPS o prawidłowej morfologii przypominającej HE będą widoczne 48 godzin po początkowym przeniesieniu na płytkę 24-dołkową. Przesiewaj kolonie ludzkich komórek iPS ręcznie co sześć do ośmiu dni, przecinając je igłą 21G. Po ekspansji klonalnej rozszerzaj hodowle na płytkę 12-dołkową, a następnie na płytkę 6-dołkową.

Po wytworzeniu ludzkich linii komórek iPS należy przeanalizować ekspresję markerów pluripotencji TRA-1-60, SSEA-4, T, 3, 4, SOX2 oraz nanog za pomocą immunocytochemii. Szczegółowa charakterystyka może obejmować analizy różnicowania in vitro i in vivo, analizę kariotypu, analizę wyciszania transgenów, badania metylacji oraz badania ekspresji genów.

Wydajna transdukcja medium zawierającym retrowirusy jest kluczowa dla skutecznego przeprogramowania w celu określenia efektywności transdukcji wirusowej. Ludzkie fibroblasty dorosłych pochodzące od pacjenta z ataksją Friedreicha zostały zobrazowane po dwóch kolejnych infekcjach medium retrowirusowym GFP; gdy fibroblasty były infekowane poprzez prostą inkubację z medium wirusowym, transdukcji uległo mniej niż 20% komórek. Jednakże, gdy po dodaniu mediów retrowirusowych GFP natychmiast zastosowano odpowiednią procedurę, wydajność transdukcji gwałtownie wzrosła.

Tutaj ponad 80% komórek zostało przetransdukowanych w celu przeprowadzenia wstępnej charakterystyki izolowanych kolonii ludzkich komórek iPS. Ekspresję markerów pluripotencji charakterystycznych dla ludzkich komórek ES oceniono metodą immunochemiczną, jak pokazano tutaj. Izolowane kolonie ludzkich komórek iPS były pozytywne pod kątem markerów pluripotencji.

T trzy cztery SOX dwa nano SSEA cztery i TRA jeden 60 DNA. Barwienie współistniejące z DPI widoczne na górnych panelach jest wykrywalne zarówno w koloniach ludzkich komórek iPS, jak i w komórkach zasilających. Wyniki te dowodzą, że ludzkie komórki iPS uzyskane za pomocą tego protokołu reprogramowania wykazują ekspresję odpowiednich markerów pluripotencji charakterystycznych dla niezróżnicowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie przeprogramować ludzkie fibroblasty w pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu transdukcji retrowirusowej, zidentyfikować prawidłowe kolonie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz przeprowadzić wstępną charakterystykę hiPSC.