Optyczny zapis aktywności elektrycznej w sieciach jelitowych świnki morskiej z użyciem barwników napięcioczułych

W niniejszym filmie zaprezentowano preparację i następne obrazowanie elektrycznie stymulowanych preparatów jelitowego układu nerwowego z wykorzystaniem napięciowo-czułego barwnika D-4-A-N-E-P-P-D-H-Q. Od pobranego od uśpionego świnki morskiej krótkiego odcinka jelita dokonuje się sekcji, aby najpierw odsłonić błonę podśluzową, a docelowo sploty mięśniowe w celu przeprowadzenia pomiarów optycznych. Po wykonaniu wstępnego obrazu o wysokiej rozdzielczości, elektrody umieszcza się na zamontowanej tkance zabarwionej barwnikiem D-4-A-N-E-P-P-D-H-Q.

Zmiany optyczne wskazujące na aktywność elektryczną są rejestrowane za pomocą kamery wysokich prędkości. Podczas akwizycji wysokiej prędkości stosowana jest stymulacja elektryczna. Obraz o wysokiej rozdzielczości jest następnie nakładany na mapę pikseli kamery wysokich prędkości w celu analizy przy użyciu programu neuro plex.

Cześć, jestem Brian Salzberg, dyrektor Laboratorium Optyki Komórkowej, czyli LOCO, jak lubimy je nazywać, w Departamencie Neuronauki na Uniwersytecie Pensylwanii. Nazywam się Analia Obide. Ja również jestem członkiem Laboratorium Optyki Komórkowej.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę rejestracji aktywności elektrycznej z nienaruszonych sieci neuronalnych ssaków przy użyciu barwników wrażliwych na napięcie. Stosujemy tę procedurę do badania łączności neuronalnej w obrębie oraz pomiędzy dwiema sieciami tworzącymi jelitowy układ nerwowy, nazywany również drugim mózgiem lub mózgiem jelita. Zatem zacznijmy.

Rozpocznij przygotowywanie preparatów podśluzówkowych oraz splotu jelitowego poprzez wycięcie jelita cienkiego świnki morskiej rasy Hartley o masie od 150 do 200 g lub wieku od dwóch do trzech tygodni, która została poddana anestezji izofluranem drogą wziewną, a następnie została zdekapitowana. Następnie usuń zawartość jelita, płucząc światło jelita ciepłym, natlenionym roztworem M1 99 DM. Wytnij fragment jelita o długości od ośmiu do 10 cm, dbając o zachowanie polarności.

Przenieś go do szklanego naczynia o średnicy 10 centymetrów powleczonego sardem, zawierającego M1 99 DM w temperaturze pokojowej. Umieść naczynie pod mikroskopem stereoskopowym z oświetleniem w ciemnym polu. Następnie, używając nożyczek, otwórz krawędź krezki i za pomocą szpilek entomologicznych przymocuj segment jelita stroną śluzową do góry.

Niezwykle ważne jest utrzymanie równomiernego napięcia, aby po przypięciu tkanka miała kształt prostokąta z regularnie wyrównanymi rzędami vii błony śluzowej, trzymając precyzyjną pęsetę Dumont z prostymi końcówkami w pozycji niemal poziomej. Oddziel błonę śluzową, chwytając VII na jednym końcu segmentu jelita i pociągając wzdłuż osi podłużnej tkanki. Kontynuuj oddzielanie pasm błony śluzowej, aby odsłonić błonę podśluzową zawierającą zwoje podśluzowe oraz naczynia krwionośne błony podśluzowej.

Następnie, używając bardzo precyzyjnych nożyczek, wykonaj nacięcie w warstwie podśluzowej zgodnie z orientacją okrężnych włókien mięśniowych. Następnie bardzo delikatnie unieś błonę podśluzową za pomocą precyzyjnej pęsety, odsuwając mięśnie okrężne. Wprowadź nożyczki głębiej i przetnij wzdłuż krawędzi podłużnych.

W miarę postępu separacji oddzielaj błonę podśluzową od reszty preparatu. Następnie wykonaj drugie cięcie zgodnie z orientacją okrężnych włókien mięśniowych w odległości od 1,5 do trzech centymetrów od pierwszego, aby określić ostateczny rozmiar preparatu podśluzowego; otrzymany segment podśluzowy ma grubość od 30 do 50 µm i wygląda jak cienka błona. Przenieś go do innego naczynia typu syl guard zawierającego świeżą pożywkę M1 99 DM i delikatnie przyszpil go, nie napinając tkanki.

Następnie należy umieścić szalkę w komorze z dostępem do tlenu w temperaturze pokojowej do późniejszego użycia. Pierwotny odcinek jelita powinien być teraz pozbawiony błony śluzowej i podśluzowej, a mięsień okrężny powinien być odsłonięty. Odcinek ten jest teraz wykorzystywany do przygotowania splotu posutrycznego w celu odsłonięcia splotu posutrycznego.

Usuń jak najwięcej warstwy mięśni okrężnych, używając pęsety precyzyjnej o prostych końcach do odciągania pęczków włókien z każdej strony preparatu. Obnażony splot mięśniowy nie może zostać oddzielony od podłużnej warstwy mięśni oraz znajdującego się pod nią CI. Przenieś preparat splotu mięśniowego do nowej szalki powleczonej sardem, zawierającej natlenione M1 99 M. Następnie luźno przypnij próbkę zawierającą żywą tkankę mięśniową. Na kilka minut przed eksperymentem optycznym przenieś preparat do nowej, mniejszej szalki powleczonej syl guardem, wypełnionej M1 99 DM z dodatkiem dwóch mikromoli nefe w celu zapobiegania skurczom mięśni, i zamocuj go stabilnie, ostrożnie umieszczając kilka bardzo cienkich pinezek wokół obwodu.

Upewnij się, że napięcie jest rozłożone równomiernie, a tkanka przylega całkowicie płasko do dna sil guard. Preparat tkankowy jest teraz gotowy do eksperymentów fizjologicznych. Przygotuj w szklanej fiolce roztwór roboczy DAI four A-N-E-P-P-D HQ w stężeniu od 5 do 50 µg/mL w M1 99 M z dodatkiem 2 µM nifedipiny i osłoń go folią aluminiową.

Ethanol z roztworu zapasowego powinien stanowić mniej niż 0,5% roztworu M1 99 DM z nifedypiną, który pokrywał preparat, a następnie należy go zastąpić przygotowanym roztworem barwnika. Używając objętości markera wystarczającej do całkowitego przykrycia tkanki, inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 do 30 minut po zakończeniu inkubacji. Przepłukać preparat utlenionym M1 99 M plus NEFE, wymieniając całą zawartość komory.

Optyczna rejestracja aktywności neuronalnej w preparatach stymulowanych elektrycznie jest przeprowadzana przy użyciu systemu składającego się z odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z oświetleniem epifluorescencyjnym, wyposażonego w rozdzielacz obrazu, szybką kamerę precyzyjną o niskiej rozdzielczości, czarno-białą kamerę o wysokiej rozdzielczości, sterowany komputerowo generator bodźców oraz mikromanipulator. Całe urządzenie jest zamontowane na aktywnym stole wibroizolacyjnym i otoczone ciężkimi kurtynami akustycznymi oraz dachem z Mylaru w celu zminimalizowania wibracji przenoszonych przez powietrze. Choć akwizycja obrazów z obu kamer może być realizowana za pomocą jednego komputera z uruchomionym oprogramowaniem Neuroplex i Global Lab Image Two lub dowolnym innym programem do akwizycji obrazów, przedstawiona tutaj konfiguracja wykorzystuje dwa komputery, z których każdy steruje oddzielną kamerą do rozpoczęcia eksperymentów optycznych.

Umieść komorę zawierającą zabarwioną próbkę płatową na stoliku mikroskopu. Ponieważ D four A i EPPD HQ są barwnikami nieprzenikającymi przez błony, które fluorescują tylko w środowisku lipidowym, zdrowe neurony z zabarwionego preparatu jelitowego powinny przy każdym powiększeniu powyżej 20 x wyglądać jak puste balony. Użyj filtrów HQ 5 35 50 do wzbudzenia, HQ 5 72 LP do emisji oraz lustra dichroicznego 5 65 nanometr.

Następnie, korzystając z manipulatora mikropozycjonującego, umieść wielokanałową liniową macierz elektrod na końcu jamnym tkanki, upewniając się, że elektroda nie dotyka obiektywu mikroskopu. Liniowa macierz zawierająca 10 elektrod wolframowych rozłożonych na odcinku jednego centymetra pozwala na pobudzenie kilku niezależnych szlaków neuronalnych i jest odpowiednia do badania wzajemnie połączonych obwodów zwojowych. Do uzyskania reprezentatywnych danych wykorzystaliśmy jednak wykonaną własnoręcznie elektrodę stymulującą z dwoma wyprowadzeniami.

Użyj wosku klejącego, aby umieścić elektrodę masy po przeciwnej stronie komory; przed wykonaniem rejestracji funkcjonalnej uzyskaj obraz czarno-biały o wysokiej rozdzielczości obszaru, z którego rejestrowana będzie aktywność elektryczna, aby ułatwić wizualizację. Skalę szarości można odwrócić tak, aby fluorescencja wydawała się ciemna. Aby zastosować stymulację prądową przy użyciu sterowanego komputerowo generatora impulsów, najpierw zaprogramuj urządzenie, wybierając odpowiednią intensywność, czas trwania, częstotliwość i liczbę bodźców, a także opóźnienie względem początku akwizycji danych optycznych.

Aby upewnić się, że stymulacja odbywa się w granicach akwizycji danych optycznych, należy skonfigurować generator impulsów jako urządzenie sterowane przez system neuro plex. Następnie w programie neuro plex należy ustawić parametry akwizycji, wskazując częstotliwość odświeżania klatek, liczbę klatek oraz wzmocnienie kamery. Aby uzyskać pełną rozdzielczość potencjału czynnościowego, częstotliwość odświeżania klatek powinna zostać ustawiona na minimum 1 kHz.

Ponieważ D four A i E-P-P-G-H-Q wykazują spadek fluorescencji podczas depolaryzacji, który jest liniowo powiązany ze zmianą napięcia, należy odwrócić wyświetlanie sygnałów optycznych w programie neuro plex, aby potencjały czynnościowe nie były widoczne w odwróconej formie. Rozpocznij akwizycję. Pamiętaj, aby przed każdą z funkcjonalnych rejestracji wykonać nowy obraz każdego pola widzenia w wysokiej rozdzielczości w kolorach czarno-białych.

Po zakończeniu akwizycji należy użyć programu neuro plex do analizy wyników w trybie offline. Obszar ekranu o nazwie page display wyświetla surowy obraz preparatu zarejestrowany przez kamerę wysokiej prędkości 80 na 80 jako pojedynczą klatkę. Gdy tryb strony jest ustawiony na absolute frame, obraz o wysokiej rozdzielczości pozyskany z drugiej kamery zostaje nałożony na mapę pikseli obrazu surowego za pomocą komend wyświetlania neuro plex.

Wymaga to zmiany trybu strony z pojedynczego śladu (absolute trace) na wiele śladów (traces) oraz wyboru nałożonego obrazu w ramach polecenia wyświetlania. Użyj myszy, aby zaznaczyć poszczególne piksele lub grupy pikseli z obrazu wyświetlanego na stronie. Wyniki z tych obszarów zainteresowania zostaną przedstawione jako ślady w oknie wyświetlania śladów, ukazując wielkość zmian optycznych rejestrowanych przez te piksele w funkcji czasu.

Odwrócenie skali szarości na obrazie o wysokiej rozdzielczości poprawia wizualizację w wyświetlaniu strony w trybie śladu i zdecydowanie zaleca się wyświetlanie analogowego wyjścia ze stymulatora. Wybierz kanał wyjścia analogowego, aby został on uwzględniony w oknie wyświetlania śladu. Wyjście to wskazuje dokładny czas podania bodźców podczas eksperymentu.

Aby wyświetlić dane w formie filmu, należy użyć poleceń movie w programie neuro plex, aby wyświetlić kolejne klatki w zbiorze danych przy użyciu skal pseudokolorów dostosowanych do maksymalnej i minimalnej zmiany intensywności fluorescencji. Zwoj z preparatu splotu miękkiego, barwiony DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q, został obrazowany za pomocą kamery o wysokiej rozdzielczości i obiektywu 60 x. Podczas akwizycji danych preparat był stymulowany serią pięciu impulsów o częstotliwości 40 hertz.

Przy amplitudzie każdego impulsu wynoszącej 15 milliamps i czasie trwania 0,5 milliseconds, zidentyfikowano cztery obszary zainteresowania (ROI), a następnie wygenerowano wykresy obrazujące dane optyczne uśrednione dla wybranych obszarów w sekwencji klatek w pseudokolorach; pierwsze regiony odpowiedzi optycznej depolaryzacji błony wskazujące na aktywność neuronalną pojawiają się w kolorach od żółtego do czerwonego. Dane te wskazują, że aktywność wywołana stymulacją występuje w określonych obszarach każdego zwoju, przenoszona głównie przez aksony przechodzące. ROI dwa, trzy i cztery identyfikują poszczególne neurony w różnych odległościach od ROI jeden.

Rysunek dwa przedstawia przy 10-krotnym powiększeniu drogi anatomiczne, którymi mogą rozprzestrzeniać się informacje; strzałki wskazują kierunek bodźca aktywującego zidentyfikowany zwoj splotowy miękkowy. Właśnie zaprezentowaliśmy elementy układu optycznego do rejestracji aktywności elektrycznej z użyciem barwników wrażliwych na napięcie oraz to, w jaki sposób zastosowanie tej technologii do układu nerwowego otwiera możliwość badania łączności funkcjonalnej wewnątrz i pomiędzy dwiema nienaruszonymi sieciami ssaków pod mikroskopem. Podczas korzystania z technologii rejestracji optycznej niezwykle ważna jest dbałość o szczegóły.

Źródła szumów optycznych, mechanicznych i elektrycznych muszą być starannie kontrolowane, a stan preparatu musi być skrupulatnie zachowany. Dlatego biegłość we wszystkich poszczególnych etapach niniejszego protokołu jest niezbędna do osiągnięcia sukcesu w rejestracji optycznej. To wszystko.

Dziękujemy bardzo za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.