Stymulacja skrawków mózgu z wykorzystaniem sieci mikrofluidycznej i standardowej komory perfuzyjnej

Głównym celem projektu, który zaprezentujemy dzisiaj, jest uzyskanie możliwości przestrzennej i czasowej kontroli stymulacji mózgu. Kolejnym kluczowym aspektem jest to, że dzięki zastosowaniu prostej modyfikacji w już i tak skomplikowanym układzie elektrofizjologicznym, możemy udostępnić to urządzenie mikroprzepływowe różnym laboratoriom, które faktycznie wykorzystują stymulację mózgu. Witam, nazywam się Java Chek Mohammad z laboratorium Edingtona w Katedrze Bioinżynierii na Uniwersytecie Illinois w Chicago.

Dzisiaj pokażę Państwu, w jaki sposób zastosujemy prosty, mikrofabrykowany układ mikroprzepływowy do stymulacji skrawków mózgu. Urządzenie do skrawków mózgu, które dzisiaj zaprezentujemy, jest bardzo użyteczne z kilku powodów; głównym z nich jest jego modułowość, dzięki której może ono zostać wkomponowane w istniejącą konfigurację elektrofizjologiczną bez konieczności wprowadzania dodatkowych modyfikacji. Ponadto pozwala ono uniknąć stosowania przewodów i pomp, które komplikują konstrukcję każdego układu mikroprzepływowego.

Ponieważ stosujemy metodę pompowania pasywnego, nie potrzebujemy żadnych przewodów ani pomp. Po trzecie, jest to po prostu cienka arkuszowa membrana z PDMS, którą umieszcza się pomiędzy szkiełkiem nakrywką a standardową komorą perfuzyjną, stosowaną w typowym układzie do elektrofizjologii. Procedura, którą zaprezentuję dzisiaj, rozpoczyna się od matrycy SU-8, wykonanej przy użyciu standardowego procesu litografii SU-8.

Matryca, którą mamy dzisiaj, jest matrycą dwupoziomową, gdzie jeden poziom zawiera projekt kanałów, czyli mikrokanałów, a drugi projekt otworów przelotowych (via), które znajdują się nad tymi kanałami, tak aby roztwory przepływające przez kanały mogły wypływać przez otwory przelotowe. Tworzymy taką matrycę na waflu krzemowym, a następnie używamy silikonu lub PDMS, który wylewamy na górę tego urządzenia, aby odcisnąć struktury znajdujące się na waflu w PDMS. Zatem wylejemy PDMS na górę tego urządzenia.

Następnie pobieramy membranę PDMS, która utworzyła się po utwardzeniu i została przyklejona do szkiełka nakrywkowego. W ten sposób otrzymujemy nasze urządzenie mikroprzepływowe. Następnie zmodyfikujemy standardową komorę perfuzyjną, nanosząc cienką warstwę PDMS na dno komory.

Kiedy już dysponujemy zmodyfikowaną komorą perfuzyjną, bierzemy wcześniej wykonane urządzenie mikroprzepływowe i przytwierdzamy je do komory perfuzyjnej. W procesie wytwarzania urządzenia mikroprzepływowego istnieją dwa krytyczne punkty. Po pierwsze, przed nałożeniem PDMS należy wyłączyć płytkę grzejną, aby PDMS nie utwardził się natychmiast po wylaniu go na podłoże krzemowe.

Kolejnym istotnym punktem jest to, że podkładki stosowane w czterech narożnikach wafla krzemowego powinny mieć wysokość mniejszą niż najwyższa struktura na waflu. Ma to zapewnić uzyskanie otworów VR podczas procesu utwardzania PDMS. Znajdujemy się obecnie w modułowej czystej ścianie (soft wall modular clean room), a to jest matryca, którą wykonaliśmy przy użyciu standardowego procesu litografii C8.

Jest to dwupoziomowy układ, w którym pierwszy poziom zawiera projekt kanałów z czterema wlotami i jednym wylotem. W środkowej części wszystkich czterech kanałów znajdują się przelotki lub słupki znajdujące się nad kanałami. Są to znaki wyrównawcze utworzone podczas procesu wykonania.

A teraz pokażę, w jaki sposób usunę go i przeprowadzę utwardzanie PDMS. Ze względu na efekt krawędziowy (edge bead effect) grubość na zewnętrznym obwodzie wafla jest większa niż w przypadku samych urządzeń w centrum. Dlatego usuniemy te znaczniki wyrównawcze za pomocą żyletki, a następnie, aby zapewnić odpowiednie obciążenie, zastosujemy przekładki o wysokości 140 micron, które umieścimy w czterech narożnikach wafla.

Należy upewnić się, że żyletka nie zbliży się do samych urządzeń. Teraz usunę cząsteczki SVA za pomocą sprężonego powietrza, zatem wafer jest już gotowy do przygotowania formy z PDMS. Przed przystąpieniem do tego kroku musimy jednak umieścić dystansory o wysokości 140 micron.

Następnie przykleję cztery kawałki taśmy w czterech narożnikach wafla. Potem upewnię się, że taśma odpowiednio przylega do wafla. Powodem, dla którego zastosowano taśmę o grubości 140 micron, jest fakt, że dwupoziomowy wzorzec z kanałami i VS ma wysokość 150 micron.

Kładąc obciążnik na PDMS podczas jego utwardzania, chcemy mieć pewność, że arkusz PDMS będzie płaski. W związku z tym w narożnikach stosujemy cztery dystanse o tej samej wysokości. Teraz pokażę, w jaki sposób będziemy przygotowywać i utwardzać PDMS, aby wykonać urządzenia.

Zanim jednak to zrobię, pokażę Państwu, w jaki sposób przygotowaliśmy roztwór PDMS. Odmierzamy 10 części bazy oraz jedną część utwardzacza i dokładnie je mieszamy. W procesie mieszania w roztworze PDMS powstaje wiele pęcherzyków powietrza; aby je usunąć, umieścimy PDMS w eksykanie. Po pozostawieniu PDMS w eksykanie przez 10 minut pęcherzyki znikają.

PDMS jest już gotowy do utwardzania. Teraz pokażę, w jaki sposób nałożymy PDMS na wafer i utwardzimy go, aby uzyskać membranę z PDMS. Nałożę PDMS na wafer, a następnie użyję tej folii przezroczystej, aby go przykryć.

Pomoże nam to usunąć wspornik urządzenia, oddzielić urządzenie od folii transparentnej, a następnie położę obciążniki na folii. Powodem zastosowania obciążników jest uzyskanie jednolitej grubości PDMS. Kolejną kluczową kwestią jest uzyskanie otworów przelotowych (via).

Zatem w każdym miejscu, w którym znajdują się otwory wentylacyjne (vs), nie chcemy obecności PDMS, a obciążniki pomogą nam tego osiągnąć. Jak widać, płyta grzejna jest wyłączona, ponieważ nie chcemy, aby PDMS utwardził się natychmiast, dlatego pozostawiamy ją wyłączoną. Następnie należy upewnić się, że podłoże krzemowe jest płaskie przed naniesieniem PDMS.

Teraz możemy nanieść przygotowany wcześniej PDMS. Należy dozować PDMS wystarczająco blisko wafla, aby nie powstawały pęcherzyki powietrza. Najważniejszym elementem jest tutaj sposób nałożenia folii przezroczystej na PDMS.

Należy upewnić się, że podczas nakładania arkusza nie powstaną pęcherzyki powietrza. Teraz położę jeden z tych szkiełek przedmiotowych, aby nadmiar PDMS mógł wypłynąć. Kładę trzy kolejne szkiełka przedmiotowe, aby upewnić się, że nie przesuną się one w przypadku tego konkretnego matryca.

W przypadku tych konkretnych elementów ustaliliśmy, że umieszczenie czterech szklanych płytek pozwala na odprowadzenie nadmiaru PDMS ze szczeliny między warstwą transparentną a waflami. Oczekujemy od jednej do dwóch minut, a następnie możemy uruchomić płytę grzewczą. W zależności od zastosowanych matryc i projektów może być konieczne zwiększenie lub zmniejszenie liczby szklanych płytek, aby uzyskać odpowiednie otwory przelotowe. Płyta grzewcza jest teraz gotowa do włączenia i ustawiam temperaturę na 75 °C.

Po osiągnięciu temperatury 75°C można ustawić timer na jedną godzinę i pozostawić PDMS do utwardzenia. Po utwardzeniu PDMS przez jedną godzinę należy wyłączyć płytkę grzejną i pozwolić jej ostygnąć do 50°C. Jest to konieczne, aby zapobiec pękaniu SEA.

Jeśli natychmiast obniżymy temperaturę z 75 stopni do temperatury pokojowej, możemy teraz wyłączyć urządzenie i poczekać, aż spadnie ona do 50 stopni Celsjusza. Gdy temperatura płyty grzejnej spadnie do 50 stopni Celsjusza, możemy zdjąć obciążniki z folii przezroczystej. Teraz możemy zdjąć wafelek z płyty grzejnej i jest on gotowy do cięcia.

Arkusz PDMS jest już gotowy do zdjęcia z matrycy C8 i musimy usunąć folię aluminiową. Następnie należy usunąć folię przezroczystą. Otrzymaliśmy w ten sposób standardową komorę perfuzyjną.

Zmodyfikowaliśmy go w taki sposób, aby umożliwić jego wyrównanie. Otwory, porty wlotowe i wylotowe urządzenia mikroprzepływowego. Są to cztery porty wlotowe i jeden port wylotowy na membranie z PDMS.

Powinny one odpowiadać czterem wlotom i jednemu wylotowi w komorze perfuzyjnej. Teraz wsunę komorę perfuzyjną i wyrównam ją z otworami w membranie PDMS. Po ich wyrównaniu całość jest gotowa do wycięcia.

Teraz można wyjąć komorę, używając sondy. Upewnij się, że wszystkie krawędzie membrany PDMS są wolne i można je usunąć. Po wykonaniu tej czynności można użyć zamrażarki, aby usunąć membranę PDMS; podczas zdejmowania PDMS z górnej części urządzenia należy przesuwać go bardzo powoli, aby nie przerwać membrany PDMS.

Teraz umieszczę na wierzchu membranę PDMS z wgłębieniami utworzonymi za pomocą matryc SC eight, dbając o to, aby była ona płaska. Robimy to, aby podczas wykonywania otworów – portów wlotowego i wylotowego – powierzchnia PDMS po stronie, która zostanie zlutowana z szkiełkiem nakrywką, nie była chropowata.

Musimy upewnić się, że wnęki znajdują się po górnej stronie. Teraz możemy stworzyć otwory wlotowy i wylotowy, aby otwory były wyraźnie widoczne. Wprowadzamy czarne tło.

Teraz przygotuję porty wlotowe i wylotowe; należy upewnić się, że w obrębie portów nie pozostał żaden PDMS. Zatem usuwamy wszelkie pozostałości PDMS. Teraz przeniesiemy membranę z PDMS na kolejną folię przezroczystą.

Następnie możemy poddać działaniu plazmy arkusz oraz szkiełko nakrywkowe, kładąc je w taki sposób, aby zagłębienia nadal znajdowały się u góry. Gdy powierzchnia arkusza i szkiełko nakrywkowe zostaną potraktowane plazmą, możemy połączyć te dwie powierzchnie w celu utworzenia sieci mikroprzepływowej i usunięcia pęcherzyków powietrza spod arkusza PDMS. Do zapewnienia szczelności można użyć taśmy klejącej.

Zapewni to, że arkusz PDMS będzie płaski, a wiązanie przebiegnie znacznie efektywniej. Następnie ponownie użyj taśmy klejącej na górnej powierzchni, aby usunąć wszelki kurz z membrany PDMS. Teraz możemy położyć szkiełko nakrywkowe, które zostanie połączone z membraną PDMS.

Teraz obie próbki PDMS oraz szkło są gotowe do obróbki plazmą. Przetraktujemy plazmą PDMS i szkiełko przykrywowe, używając tego zmodyfikowanego mikrofalowego systemu plazmowego, w którym szklana komora umożliwia wytworzenie plazmy wewnątrz mikrofalówki. Umieśćmy próbki wewnątrz, tworząc próżnię w komorze.

Teraz mogę wpuścić tlen. System plazmowy jest już gotowy; w celu wizualizacji plazmy w tym konkretnym układzie zastosuję moc 10% i czas 10 sekund. W trakcie trwania obróbki plazmowej zwiększyliśmy moc do 100% i wyłączyliśmy światła.

A teraz można zobaczyć plazmę bezpośrednio po obróbce plazmowej. Należy niezwłocznie połączyć obie powierzchnie, szkiełko przykrywowe i PDMS, w przeciwnym razie powierzchnia PDMS utraci hydrofilowość uzyskaną dzięki obróbce plazmowej. Po ułożeniu szkiełka przykrywowego upewnij się, że cała powierzchnia jest ze sobą ściśle połączona, bez pęcherzyków powietrza.

Jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza, można je usunąć. Teraz odstawiamy zestaw na pięć minut, aby nastąpiło związanie. Oto zmodyfikowana komora perfuzyjna, w której zmodyfikowano podstawę komory za pomocą PDMS.

Zostało to wykonane wcześniej. Umieściliśmy folię przezroczystą na wyłączonej płycie grzewczej, a następnie wylaliśmy PDMS, który został przygotowany w sposób analogiczny do opisanego wcześniej.

Następnie umieściliśmy komorę perfuzyjną na wierzchu PDMS, a potem położyliśmy pojedynczy ciężarek, jak pokazano tutaj, i pozostawiliśmy do utwardzenia przez 30 minut w temperaturze 75 °C. Teraz, podczas gdy czekamy na połączenie PDMS z szkiełkiem nakrywką, pokażę, jak można przygotować komorę. W ten sposób będziemy mogli połączyć komorę z urządzeniem mikroprzepływowym.

Należy usunąć nadmiar PDMS z miejsc, w których nie jest on potrzebny. Najpierw zdejmij folię ochronną, a następnie usuń PDMS. Następnie należy usunąć PDMS z portów wlotowego i wylotowego. Teraz komora jest gotowa do połączenia z przygotowanym wcześniej urządzeniem mikroprzepływowym.

Po odczekaniu pięciu minut urządzenie mikroprzepływowe jest gotowe do oddzielenia od folii przezroczystej, jednak należy upewnić się, że folia jest usuwana powoli. Dzięki temu PDMS i szkiełko nakrywka nie rozdzielą się. Po przygotowaniu komory perfuzyjnej należy poddać działaniu plazmy dolną powierzchnię komory, w której właśnie naniesiono PDMS, oraz górną powierzchnię urządzenia mikroprzepływowego z nałożonym PDMS.

Teraz umieścimy oba te elementy w komorze plazmowej i przeprowadzimy traktowanie plazmą przy mocy 10% przez 10 sekund. Obie powierzchnie zostały teraz poddane działaniu plazmy i są gotowe do połączenia. Przed połączeniem należy upewnić się, że porty wlotowe i wylotowe w komorze są wyrównane z urządzeniem mikrofluidycznym.

Ponieważ wyrównywane elementy są wystarczająco duże, nie jest potrzebny żaden specjalistyczny sprzęt i można to wykonać gołym okiem. Po wyrównaniu i umieszczeniu elementu na komorze, należy upewnić się, że wszystkie powierzchnie stykają się, a następnie pozostawić go na pięć minut. Po odczekaniu pięciu minut wiązanie będzie wystarczająco trwałe do przeprowadzenia eksperymentów.

Po połączeniu urządzenia mikroprzepływowego z komorą, nadamy powierzchniom kanałów właściwości hydrofilowe. Dzięki temu roztwór A CFS lub inne neuroprzekaźniki będą mogły przepływać przez nie łatwiej. W tym celu umieszczę całe urządzenie w plazmie i poddam je działaniu plazmy przez jedną minutę przy 10%, tak aby wszystkie wewnętrzne powierzchnie kanałów stały się hydrofilowe.

Następnie napełnię go wodą i przeniosę do zestawu elektrofizjologicznego, abyśmy mogli przeprowadzić właściwe eksperymenty. Dobrze, teraz jesteśmy gotowi, aby przejść do zestawu elektrofizjologicznego i faktycznie użyć tego urządzenia z przekrojem mózgu. Cześć, nazywam się uo.

Współpracuję z dr Arrington i dr Fall z Katedry Bioinżynierii na Uniwersytecie Illinois. Teraz będę pracować z urządzeniem micro free, które przyniosłem i umieściłem na tej platformie. Po jednej stronie widzimy przewody perfuzyjne.

Z drugiej strony widoczna jest rurka ssąca. Urządzenie zostanie przepłukane roztworem płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), napowietrzonym mieszanką 95% tlenu i 5% CO2. Teraz, gdy urządzenie micro V jest gotowe, pobiorę plasterki mózgu, a następnie umieszczę je na urządzeniu mikro.

Teraz umieszczę przekrój mózgu na górze okrągłych otworów, a następnie użyję kotwicy, aby go unieruchomić. Po unieruchomieniu przekroju mózgu zastosuję neuroprzekaźniki w celu jego stymulacji. W tym miejscu znajdują się cztery wloty, więc wprowadzę neuroprzekaźnik do każdego z nich, wykorzystując pompowanie pasywne z tych czterech wlotów do tego wylotu.

A teraz dr Fall opowie o tym urządzeniu oraz o tym, dlaczego jest ono dla nas tak ważne. Cześć, jestem Chris Fall i zajmujemy się fizjologią mózgu.

Powodem, dla którego musimy stosować przekroje mózgu, jest możliwość dostępu za pomocą mikroelektrod oraz technologii obrazowania. Do tej pory jedynym sposobem zmiany środowiska neuroprzekaźników w tych przekrojach mózgu była zmiana przepływu nad całym przekrojem lub bezpośrednie podawanie neuroprzekaźników za pomocą bardzo małej mikropipety. Dlatego jesteśmy bardzo zadowoleni z możliwości współpracy z grupą Eddingtona.

Ta nowa technologia pozwoli nam na oddziaływanie na duże obszary mózgu i lokalną zmianę środowiska neuroprzekaźników. Następnie będziemy mogli jednocześnie zastosować elektrody oraz technologię obrazowania, a w przyszłości być może zintegrować urządzenia do wielokanałowych rejestracji elektrodowych w jednej jednostce. Tutaj widać przekrój mózgu myszy w urządzeniu mikroprzepływowym.

Można zauważyć nawet gołym okiem, że mózg składa się z wielu różnych obszarów. Obszary te pełnią odmienne funkcje. W żywym organizmie te różne regiony mózgu charakteryzują się odmiennym poziomem neuromodulacji i stężeniem neuroprzekaźników.

Chcemy mieć możliwość powtórzenia tego w naszej komorze do skrawków podczas wykonywania rejestracji elektrofizjologicznych oraz obrazowania. Dlatego niezwykle ważne jest móc oddziaływać na te różne obszary za pomocą różnych neuroprzekaźników, w różnych stężeniach i w różnych ramach czasowych. Ponieważ nie możemy bezpośrednio wizualizować neuroprzekaźników, pokażemy tutaj przykład barwnika fluorescencyjnego, który jest wpompowywany w różne regiony skrawka mózgu.

W tym filmie obserwujemy przepływ fluorescencyjnego barwnika przez kanały urządzenia i wizualizację jego wypływu z wykonanych porów. Nawet w tym wczesnym prototypie widać, jak precyzyjna jest rozdzielczość przestrzenna przepływu. Obserwując film, zobaczą Państwo barwnik wpływający do kanałów, a następnie wypływający przez otwory, po czym barwnik zostanie wypłukany, co pozwoli ocenić rozdzielczość czasową przepływu.

Dziękujemy za dołączenie do nas. Myślę, że udało nam się zademonstrować, w jaki sposób mikrofluidyka, a wręcz mikro maszyny, mogą zostać połączone z tradycyjnymi technikami fizjologicznymi, aby pomóc nam zrozumieć, jak działa mózg. Dziękuję.