Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie populacji protoplastów specyficznych dla konkretnego typu komórek z liścia. Osiąga się to najpierw poprzez hodowlę roślin wykazujących ekspresję GFP w określonych typach komórek liścia. Drugim krokiem jest pobranie liści i wygenerowanie protoplastów za pomocą trawienia enzymatycznego.

Następnie protoplasty są filtrowane i sortowane za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek lub FACS. Ostatnim krokiem jest potwierdzenie dokładności sortowania przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Ostatecznie posortowane protoplasty mogą zostać wykorzystane do analizy ekspresji genów specyficznej dla danego typu komórek, analizy proteomicznej lub profilowania metabolicznego.

Fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS) było wcześniej z sukcesem stosowane w przypadku korzeni, lecz w niniejszym przypadku służy ono do izolowania komórek liści. Stosowanie znakowania GFP przed tą metodą było ograniczone ze względu na zakłócenia wywołane fluorescencją chlorofilu. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ szybkie, lecz staranne przygotowanie próbek ma decydujące znaczenie dla zminimalizowania rozległych zmian fizjologicznych, które mogą wystąpić podczas sortowania komórek.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ nie wiedzą, jak skonfigurować sorter komórkowy ani w jaki sposób potwierdzić poprawność sortowania. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii systemów roślin. Problem z identyfikacją sieci regulacji genów w złożonych organach wielokomórkowych, takich jak liść, polega na tym, że różne typy komórek wykazują ekspresję różnych grup genów.

Informacje genetyczne te są tracone podczas analizy zbiorów całego liścia, co demonstruje ta procedura. Towarzyszyć mi będą Ellison As i Sanjeev Kuma, którzy zapewniają wsparcie techniczne dla tych prac w naszym laboratorium. Najpierw należy napełnić dziewięciocentymetrową okrągłą płytkę Petri 20 ml roztworu A zawierającego enzymy do przygotowania płytek oraz inhibitory transkrypcji i RNA.

Następnie pobierz odpowiedni materiał z liści dla próbek zawierających więcej niż jeden liść, tak jak w przykładzie pokazanym tutaj. Ułóż liście w stosie składającym się z maksymalnie 15 liści. Następnie za pomocą żyletki potnij liście na paski o szerokości jednego milimetra.

Natychmiast przenieś paski liści do szalki Petriego za pomocą płaskich pęset, delikatnie je rozdziel, a następnie poddaj próbki dwukrotnej infiltracji próżniowej, po pięć minut za każdym razem. Następnie umieść szalkę Petriego na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 90 RPM w temperaturze pokojowej i inkubuj próbki protoplastów przez trzy do czterech godzin. W czasie inkubacji co pół godziny rozdziel paski liści od siebie za pomocą pęsety.

Po trawieniu delikatnie przefiltruj roztwór protoplastów przez sitko komórkowe o rozmiarze oczek 70 µm do probówki o pojemności 50 mL. W ten sposób paski liści zostaną zatrzymane, a protoplasty przejdą przez sito.

Następnie należy użyć czterech mililitrów roztworu A, aby delikatnie wypłukać paski liści, zbierając płuczyny do probówki o pojemności 50 mililitrów. Potem zawiesinę protoplastów przenosi się do probówek z okrągłym dnem i odwirowuje protoplasty przez pięć minut przy 300 ×g w temperaturze pokojowej. Uważając, aby nie naruszyć osadu, należy delikatnie odprowadzić za pomocą pipety jak najwięcej nadnadziele, a następnie przemyć protoplasty pięcioma mililitrami roztworu A w tych samych warunkach wirowania.

Na koniec, po usunięciu pływającego znad osadu nadpływu, należy użyć obciętej końcówki P 1000, aby resuspenderować PROTOPLASTY w odpowiedniej objętości roztworu A bezpośrednio przed sortowaniem. Aby rozbić grudki w roztworze protoplastów, należy użyć nieobciętej końcówki P 1000. Następnie należy przeprowadzić dalszą dysocjację komórek, filtrując protoplasty do probówki sorteryjnej przez filtr fillon o wielkości oczek 50 micron.

Następnie odpowiednio rozcieńczyć zawiesinę komórkową, aby zapobiec zapychaniu dyszy pobierającej komórki. Po ustaleniu optymalnych warunków pobierania komórek, zidentyfikować protoplasty GFP-dodatnie, wykorzystując laser Argonowy o długości fali 488 nm, analizując sygnał z filtra pasmowo-przepustowego 580/30 w zestawieniu z filtrem pasmowo-przepustowym 530/40. Należy pamiętać, że protoplasty GFP-dodatnie będą widoczne w populacji o wysokim sygnale 530 i niskim sygnale 580.

W populacji protoplastów niewykazujących fluorescencji GFP o niskich wartościach 530 i 580, martwe i obumierające protoplasty oraz debris pojawiają się w populacji o wysokich wartościach 580. W celu wizualizacji posortowanych protoplastów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, należy sortować protoplasty bezpośrednio do co najmniej ośmiokrotnej objętości roztworu A. Po sortowaniu protoplasty należy skoncentrować poprzez wirowanie. Protoplasty mogą być sortowane do ośmiu objętości roztworu A i zbierane do wizualizacji pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu weryfikacji wzbogacenia. Pierwszy obraz przedstawia przykład wzbogacenia linii komórkowej TP 382, która wykazuje ekspresję GFP w komórkach szparkowych. Przykłady uzyskowych wydajności z zastosowaniem tej metody, zarówno przed, jak i po amplifikacji, podsumowano w poniższej tabeli.

Ilości od 500 picogramów do 50 nanogramów są wystarczające do amplifikacji za pomocą systemu ovation PICO WTA i późniejszej analizy za pomocą ilościowego PCR, sekwencjonowania nowej generacji lub mikromacierzy. Kolejna seria obrazów przedstawia różne linie komórkowe protoplastów wyizolowane i posortowane opisaną przed chwilą metodą. Pierwsze protoplasty pochodzą z KC 2 74, liście, przekrój poprzeczny KC 2 74.

Liść wykazuje, że GFP jest ekspresyjne w układzie naczyniowym. Protoplasty te wyizolowano z liści KC 4 64, a przekrój poprzeczny liścia KC 4 64 pokazuje, że ekspresja GFP występuje w epidermie A dal. Ostatecznie protoplasty te pochodziły z liści TP 3 82 w liściach TP 3 82.

GFP ulega tutaj ekspresji w komórkach szparkowych. Przedstawiono typowe wykresy kropkowe z akwizycji danych, ilustrujące sygnał z filtrów pasmowych 580±30 nm oraz 530±40 nm. Wyznaczone bramki sortowania to te, które są zazwyczaj stosowane podczas procesu sortowania.

Ten pierwszy wykres kropkowy protoplastów pochodzących z liści linii col-4, poddanych protoplastyzacji w obecności inhibitorów, pokazuje pojedynczą populację o niskiej fluorescencji 530 i niskiej fluorescencji 580. Natomiast ten wykres kropkowy protoplastów pochodzących z liści linii col-4 typu dzikiego, poddanych protoplastyzacji w obecności inhibitorów, wykazuje przesunięcie w fluorescencji 580, które występuje w wyniku stresu i barwienia wywołanego przez inhibitory. Przedstawione wykresy kropkowe dotyczą protoplastów z liści odpowiednio linii KC 74, KC 464 i TP 382.

Próbki te poddano również analizie w obecności inhibitorów, co wykazało, że GFP znajduje się w populacjach o wysokim sygnale 530 i niskim 580. W tym reprezentatywnym eksperymencie ilościowego PCR najpierw pozyskano próbki dla każdego rodzaju frakcji. Następnie próbki powielono przy użyciu systemu ovation PICO WTA oraz ilościowego PCR.

Przeprowadzono analizę z wykorzystaniem specyficznych starterów do GFP. Przedstawione wartości to najwyższe (zaznaczone na czerwono) i najniższe (zaznaczone na zielono) wartości średnie lub pojedyncze; poziomy z wykorzystaniem aktyny 2 jako genu referencyjnego zaznaczono poziomymi żółtymi paskami. Wyniki stanowią weryfikację optycznych ocen zawartości GFP w posortowanych frakcjach komórkowych.

Populacja high 530 low 580 wykazywała najwyższe mierzalne poziomy ekspresji GFP. Podczas gdy populacja high 530 high 580 wykazywała ekspresję GFP około 1000 razy niższą, populacje low 530 low 580 oraz low 530 high 580 wykazywały niskie poziomy ekspresji GFP, które były porównywalne z poziomami w kontrolnych populacjach całych liści oraz niesortowanych protoplastów. Po opanowaniu techniki tej, proces od rośliny do posortowanej populacji komórek może zająć od czterech do pięciu godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby stale monitorować sorter komórkowy i w razie potrzeby go rekalibrować w celu zachowania dokładności sortowania.

Znaleziono tę procedurę. W celu porównania i zestawienia poziomów ekspresji genów w różnych typach komórek można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza microray. Dzięki opracowaniu tej techniki analizujemy obecnie ekspresję genów w określonych typach komórek liściowych na różnych etapach rozwoju, a następnie porównamy te wyniki z danymi z całego liścia, które zostały wygenerowane w ramach projektu agrotechnicznego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować pojedyncze typy komórek liści za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS).