Rozszyfrowanie dróg aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej kurczaka z wykorzystaniem elektroporacji in ovo

Witam, nazywam się Ham i pochodzę z laboratorium dr Review Klar z wydziału neurobiologii medycznej na Uniwersytecie Hebrajskim w Jerozolimie. Witam, jestem Sophie Esman, również z laboratorium dr Lars. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu procedurę elektroporacji in vivo oraz przygotowanie preparatu rdzenia kręgowego metodą „otwartej książki”.

W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania trajektorii aksonów genetycznie zdefiniowanej populacji neuronów w zarodkowym rdzeniu kręgowym. Przejdźmy zatem do realizacji. Aby rozpocząć procedurę, przenieś zapłodnione jaja białych kur kurnikowych (leghorn) z temperatury pokojowej do nawilżonego inkubatora, najlepiej z talami kołyszącymi, w temperaturze od 37 do 38 °C.

Ważne jest monitorowanie temperatury i wilgotności w inkubatorze, aby uzyskać żywotne i zsynchronizowane embriony. Embriony kurcząt poddaje się elektroporacji, gdy osiągną stadium hamburger i Hamilton (HH) 18 do 20, które jest optymalnym etapem dla specyficznej ekspresji zależnej od enhancera. Na tym etapie głowa znajduje się pod kątem prostym względem tułowia.

Również w stadiach HH 18 do 20 powinien być widoczny rozległy zestaw pozazarodkowych naczyń krwionośnych, takich jak przednie i tylne naczynia linii żywotnej po stronie prawej i lewej. Zarodki kurczego osiągają stadia HH 19 do 20 po 66 godzinach inkubacji; w tym czasie należy wyjąć jaja z inkubatora. Po wyjęciu jaj ułożyć je poziomo i odczekać od pięciu do 10 minut. Zarodek znajduje się obecnie w górnym biegunie jaja.

Przed elektroporacją należy przygotować roztwór Hank'a z dodatkiem 100 units per milliliter penicyliny i 0,1 milligrams per milliliter streptomycyny. Należy przygotować odpowiednią mieszaninę DNA o stężeniu od dwóch do pięciu micrograms per microliter i dodać kilka ziaren barwnika fast green w celu łatwiejszej wizualizacji wstrzykniętego DNA. Należy również przygotować pipetę ustną, sterylną igłę do strzykawki, małe nożyczki oraz taśmę.

Przygotować mikrokapilary poprzez wyciągnięcie kapilar szklanych o średnicy 0,5 milimetra za pomocą wyciągarki do pipet. Umieścić elektrody wolframowe w mikromanipulatorach i podłączyć je do generatora impulsów. Ustawić napięcie generatora impulsów na -30 voltów, długość każdego impulsu na 50 milliseconds oraz liczbę impulsów na trzy.

Przed odsłonięciem i manipulacją zarodkami należy przystąpić do elektroporacji. Wprowadzić strzykawkę w wąski biegun jaja i usunąć od pięciu do sześciu mililitrów albuminy z każdego jaja. Albuminę usuwa się, aby zapobiec jej wylewaniu się.

Podczas wycinania w następnym kroku należy użyć małych nożyczek. Po odsłonięciu zarodka kurczaka wycina się owalne okienko w górnej części jaja, a następnie nawilża je 0,5 do 1 ml roztworu hanksa z penicyliną i streptomycyną. Następnie, za pomocą pipety ustnej, należy napełnić szklaną mikrokapilarę.

Używając mieszaniny barwnika do DNA, należy łatwo napełnić mikrokapilarę o odpowiedniej średnicy DNA. Pod mikroskopem stereoskopowym należy ustawić embrion w celu wstrzyknięcia DNA do rurki nerwowej. Umieść embrion tak, aby jego ogon był skierowany w Twoją stronę.

Na tym etapie rozwoju rdzeń kręgowy jest wyraźnie widoczny, w związku z czym techniki kontrastowania nie są wymagane. Rdzeń kręgowy jest zamknięty zarówno po stronie głownej, jak i ogonowej. Podczas nakłuwania mikrokapilarą należy wykonać otwory w rurze nerwowej, penetrując ją pod niewielkim kątem; mikrokapilara o odpowiednio małej średnicy powinna przebić rurę bez powodowania jej uszkodzenia.

Wstrzyknij DNA za pomocą pipety ustnej. Mikrokapilara o odpowiedniej średnicy powinna uwolnić DNA podczas miarowego wydechu. Zielony barwnik powinien rozprzestrzenić się od końcówki ogona aż po pęcherzyki rozwijającego się mózgu.

Wstrzykuj, aż rurka neuralna zostanie wypełniona; aby wstrzyknięte DNA mogło wniknąć do komórek, wymagana jest elektroporacja DNA. Najpierw umieść elektrody równolegle do rurki neuralnej i tak blisko niej, jak to możliwe, nie dotykając samej rurki. Upewnij się, że elektrody są zanurzone w cieczy, aby zapewnić przewodnictwo elektryczne podczas impulsu.

Zazwyczaj roztwór Hanksa dodany bezpośrednio po odsłonięciu zarodka jest wystarczający. Jeśli jednak nie jest to możliwe, należy dodać jedną kroplę roztworu Hanksa tuż przed impulsem, z pozycjonowanymi i zanurzonymi w cieczy elektrodami, a następnie podać impuls w celu przeprowadzenia elektroporacji. Następnie należy ostrożnie usunąć elektrody i zabezpieczyć okno oraz jajko taśmą. Ważne jest całkowite uszczelnienie jajka, aby zapobiec wysuszeniu zarodka podczas następnego okresu inkubacji.

Umieść jajko z powrotem w inkubatorze i inkubuj, aż embrion kurczaka osiągnie odpowiedni stopień rozwoju. W szóstym dniu (E6), gdy nadejdzie czas obrazowania i embrion poddany elektroporacji osiągnie szósty dzień rozwoju (E6), trzy dni po elektroporacji, usuń go z jajka za pomocą precyzyjnych nożyczek i umieść w powleczonej silikonem szalce Petriego zawierającej PBS.

Odciąć błony i rozciągnąć embrion stroną brzuszną, używając szpilek wbitych w silikon w celu jego unieruchomienia. Za pomocą ostrej mikrokapilary wolframowej wykonać nacięcie podłużne wzdłuż płytki dachowej od tylnego mózgu aż do ogona.

Wykonaj dwa dodatkowe nacięcia wzdłużne po obu stronach rdzenia kręgowego, oddzielając zwoje korzeni grzbietowych (DRG) od rdzenia kręgowego. Oddziel płytkę dna od tkanki, zaczynając od ogona w kierunku tylnego mózgu, pozostawiając rdzeń kręgowy nienaruszony. Na koniec, za pomocą precyzyjnych nożyczek, przetnij rdzeń kręgowy w przekroju poprzecznym na wysokości tylnego mózgu i oddziel rdzeń kręgowy od ciała.

Po wyizolowaniu rdzenia kręgowego, należy rozłożyć go w nowej pokrytej silikonem szalce Petriego zawierającej PBS, używając pinezek do przymocowania go od tylnego mózgowia do ogona, w celu przygotowania preparatu typu flat mount. Utrawić rdzeń kręgowy w 4%paraldehydzie w PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przeprowadzić barwienie immunocytochemiczne zgodnie z procedurą immunohistochemii opisaną w towarzyszącym protokole pisemnym, aby zamocować otwarty rdzeń kręgowy. Przygotować preparat do obrazowania.

Nanieść smar lub silikon w kształcie prostokąta na szkiełko podstawowe i ukraplać PBS wewnątrz prostokąta. Za pomocą pęsety umieścić rdzeń kręgowy, rozciągając go w środkowej części prostokąta, a następnie odessać nadmiar cieczy z jego otoczenia. Za pomocą pipety nanieść jedną lub dwie krople medium montażowego na rdzeń kręgowy i przykryć szkiełkiem nakrywką.

Przyciśnij szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza. Przechowuj preparaty w ciemności w temperaturze 4 °C.

Zbadaj rdzeń kręgowy za pomocą mikroskopii konfokalnej. Oto reprezentatywne wyniki odrzutów aksonalnych interneuronów rdzenia kręgowego kurczaka w eksperymentach kontrolnych, w których RFP jest ekspresowane we wszystkich neuronach z wykorzystaniem powszechnego elementu wzmacniającego CMV; większość neuronów i ich aksony są znakowane. Rozszyfrowanie przebiegu aksonów subpopulacji neuronów jest w tym przypadku niemożliwe.

Jednakże po zastosowaniu specyficznych elementów wzmacniających ujawniony zostaje zdefiniowany szlak aksonalny konkretnej subpopulacji neuronów DI 2 w tym przykładzie. Właśnie zaprezentowaliśmy zatem sposób elektrotomycznej operacji rurki neuralnej piszczela z zastosowaniem specyficznego wzmacniacza neuronalnego w stadium E3 oraz sposób przygotowania rdzenia kręgowego w formie otwartej księgi w stadium E6. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu ostrożności i cierpliwości.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach. Powodzenia.