Identyfikacja fenotypów hamowania wzrostu indukowanych przez ekspresję bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach

Aby rozpocząć ten protokół, należy wybrać wektor do ekspresji wybranego efektora bakteryjnego. W przypadku drożdży i konkretnego szczepu drożdży, wektor jest następnie transformowany do komórek drożdży. Następnie indukuje się ekspresję efektora.

Indukowane komórki poddaje się lizie w celu przeprowadzenia analizy western blot, aby zweryfikować ekspresję efektora. Po potwierdzeniu ekspresji efektora komórki są hodowane, a następnie ich dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne są nanoszone na pożywki represyjne i indukujące. Ostatecznie, po dwóch do trzech dniach, analizowany jest wzrost drożdży.

Witajcie, jestem Do Solomon z laboratorium dr. Guida Cesy w Katedrze Nauk o Roślinach na Uniwersytecie w Tel Awiwie. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę identyfikacji fenotypów hamowania wzrostu indukowanych przez ekspresję bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania funkcji efektorów typu III pochodzących z gram-ujemnych bakterii patogennych; jest ona narzędziem, które pomaga nam w identyfikacji celów efektora TIC.

Zacznijmy zatem. Projektując system drożdżowy odpowiedni do ekspresji interesujących nas efektorów typu trzeciego, należy wziąć pod uwagę i zoptymalizować kilka istotnych czynników. Pierwszym z nich jest promotor sterujący ekspresją efektorów.

Ponieważ bakteryjne efektory typu trzeciego mogą być toksyczne dla komórek drożdży, do kontroli ich ekspresji należy użyć promotora indukowalnego. W tym doświadczeniu wykorzystamy promotor GAL1. Drugim czynnikiem jest liczba kopii genu efektora.

Wysokie poziomy ekspresji są osiągane, gdy gen efektora jest przenoszony przez plazmid 2 µm. Ekspresję pośrednią uzyskuje się przy użyciu plazmidu zawierającego centromer, natomiast niską ekspresję osiąga się, gdy gen efektora zostanie zintegrowany z genomem drożdży poprzez rekombinację homologiczną. Trzecim czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest znacznik epitopowy stosowany do weryfikacji ekspresji białka w przypadkach, gdy niedostępne są przeciwciała przeciwko badanemu efektorowi.

Najczęściej stosowanymi znacznikami są hemaglutynina M HA lub flag, do których dostępne są niezawodne przeciwciała komercyjne. Sugerujemy stosowanie tylko jednej kopii znacznika, aby zminimalizować niepożądane, szkodliwe efekty wpływające na strukturę i aktywność białka efektorowego. I wreszcie, szczep drożdży użyty do ekspresji musi być troficzny w stosunku do markera selekcyjnego wektora ekspresyjnego.

Aby wyhodować komórki drożdży do transformacji, należy pobrać kolonię drożdży ze świeżej płytki i zaszczepić trzy mililitry YPD w 15 mililitrowej probówce polipropylenowej, a następnie wymieszać na wirówce typu vortex. Krótko umieść probówkę z kulturą w walcarku i inkubuj przez noc w temperaturze 30 °C przy stałej rotacji. Następnego ranka wyjmij kulturę z walcarku i odwiruj przy 800 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po wirowaniu całkowicie usuń nadsącz i resuspenduj komórki w jednym mililitrze buforu do resuspendowania Resus, mieszając za pomocą wortexa z maksymalną prędkością przez około 10 sekund. Dla każdego plazmidu przeznaczonego do transformacji oraz dla dodatkowej transformacji kontrolnej przenieś 100 µL zawiesiny komórkowej do probówki do mikrocentryfugi. Do każdej probówki, z wyjątkiem probówki kontrolnej, dodaj pięć µL jednoniciowego DNA nasienia łososia oraz od 250 do 500 ng DNA plazmidowego.

Następnie ostrożnie dodaj 650 µL roztworu transformacyjnego do każdej probówki i wymieszaj w wirówce vortex. Inkubuj probówki w temperaturze 30 °C przez 30 minut na walcarku. Po zakończeniu inkubacji dodaj 70 µL DMSO do każdej probówki i wymieszaj poprzez odwrócenie probówek od 10 do 15 razy, aby uniknąć rozbicia komórek.

Nie należy wstrząsać probówek na wirówce typu vortex. Probówki należy umieścić w podgrzanej do 42 °C kąpieli wodnej i inkubować przez 15 minut. Po 15 minutach należy wyjąć probówki z kąpieli wodnej i natychmiast umieścić je w lodzie na dwie minuty.

Po ostygnięciu probówek należy zebrać komórki poprzez wirowanie, a następnie za pomocą pipety ostrożnie usunąć lepki nadsącz. Każdy osad należy zawiesić w 150 µL sterylnej wody dwukrotnie destylowanej i rozsiać zawiesinę komórek na płytce z odpowiednią pożywką selektywną. Płytki należy pozostawić otwarte przez dwie minuty, aby wyschły w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

Następnie płytki należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 30 °C na dwa do trzech dni w celu hodowli komórek drożdży. Aby przygotować ekstrakt białkowy, należy zaszczepić 3 mL odpowiedniego podłoża represyjnego kolonią drożdży ze świeżej płytki i wymieszać na wirówce vortex. Następnego dnia probówkę z kulturą należy umieścić na krótko w inkubatorze obrotowym w temperaturze 30 °C.

Wyjąć kulturę z walca i wirować przy 800 Gs przez pięć minut w temperaturze pokojowej, odrzucić nadsącz i zawiesić ponownie osad komórkowy. W trzech mililitrach sterylnej DDW wymieszać za pomocą wortexa, ponownie wirować, odrzucić nadsącz i zawiesić komórki w trzech mililitrach sterylnej DDW. Następnie przenieść 200 microliters zawiesiny komórkowej do nowej probówki o pojemności 15 milliliter zawierającej trzy mililitry odpowiedniego medium indukcyjnego wymieszanego za pomocą wortexa.

Umieść probówkę w walcarku i inkubuj przez noc w temperaturze 30 °C. Następnego dnia rano przenieś 1 mL kultury (lub więcej w przypadku kultur o niskiej gęstości) do probówki do mikrowirówki. Zbierz komórki poprzez wirowanie przy 800 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej; od tego momentu pracuj w dygestorium, aby uniknąć wdychania toksycznych oparów etanolu Beamer capto.

Ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pipety i resuspenduj osad komórkowy w 100 µL lodowatego roztworu lizującego. Wymieszaj intensywnie za pomocą wirówki laboratoryjnej i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Podczas 30-minutowej inkubacji określ objętość kwasu solnego o stężeniu 6 M wymaganą do miareczkowania 100 µL buforu lizującego do pH od 9 do 10.

Aby to zrobić, dodaj różne objętości kwasu solnego do 100 µL buforu lizującego w 10 różnych probówkach, a następnie sprawdź pH roztworu za pomocą paska wskaźnika pH po zakończeniu inkubacji przy odpowiedniej objętości kwasu solnego dodanego do lizatu i wymieszaj za pomocą wortexa. Następnie dodaj 50 µL trzykrotnego buforu do próbek do lizatu i wymieszaj za pomocą wortexa, przebij igłą otwór w zakrętce probówki do wirówki i gotuj roztwór lizatu na bloku grzewczym przez pięć minut. Po gotowaniu pozostaw roztwór do ochłonięcia na dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Następnie wymieszać roztwór lizatu w wirówce vorex i odwirować go przez 10 sekund. Lizat jest teraz gotowy do analizy immunologicznej krwi w celu przygotowania komórek do testu plamkowego. Następnego dnia wyhodować kultury każdego szczepu o objętości trzech mililitrów, zgodnie z wcześniejszym opisem.

Przygotować dwie płytki zawierające syntetyczną pożywkę kompletną bez leucyny. Pożywkę na jednej płytce należy uzupełnić o 2%glucose, a na drugiej o 2%actose i 1%raffinose. Osuszyć płytki w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Zbiór komórek i ponowne zawieszenie każdego osadu komórkowego w trzech mililitrach sterylnej DDW. Powtórz etap wirowania i ponownie zawieś komórki w trzech mililitrach sterylnej DDW. Wyznacz gęstość optyczną lub OD każdej hodowli, a następnie przygotuj w sterylnych probówkach mikropoistycznych zawiesiny komórkowe o objętości jednego mililitra i OD 600 równej 1.

Następnie przygotuj trzy dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne z każdej z zawiesin komórkowych, używając trzech sterylnych mikroprobówek wypełnionych 900 µL sterylnej wody DDW. Umieść suche płytki na siatce i dla każdej hodowli nanieś po 10 µL z czterech rozcieńczeń w rzędzie. Po naniesieniu próbek pozostaw płytki otwarte w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez kilka minut.

Gdy plamki wyschną, przykryj płytki i umieść je w inkubatorze w temperaturze 30 °C na dwa do trzech dni. Teraz przedstawimy wyniki testu plamkowego na drożdżach w celu wykrycia inhibicji wzrostu. Fenotypy wywołane ekspresją efektorów typu trzeciego: efektorów typu trzeciego A-V-R-P-T-O hop, AA one one oraz AAV RE one bakterii.

Białka Pseudomonas syringae z patogenu pomidora były wyrażane z plazmidu zawierającego centromer w szczepie drożdży na podłożu represyjnym. Szczepy drożdży niosące plazmid do ekspresji AvrPto oraz HopAA1 wykazały wzrost podobny do szczepu kontrolnego zawierającego pusty wektor. Podczas gdy drożdże niosące AvrRE1 wykazały nieco zredukowany wzrost, prawdopodobnie z powodu nieszczelności promotora GAL1 i wysokiej cytotoksyczności AvrRE1, w warunkach indukujących ekspresja AvrRE1 lub HopAA1 spowodowała drastyczny fenotyp zahamowania wzrostu, objawiający się brakiem kolonii w każdym rozcieńczeniu. W przeciwieństwie do tego ekspresja AvrPto nie wywarła żadnego efektu hamującego wzrost.

Właśnie pokazaliśmy, jak identyfikować fenotypy hamowania wzrostu wywołane ekspresją bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby starannie dobrać wektor ekspresyjny oraz szczep, ponieważ oba te elementy mogą mieć znaczący wpływ na wyniki. Ponadto należy pamiętać o wykorzystaniu świeżo transformowanych kolonii na wszystkich etapach procedury.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.