Spektrometria mas z mobilnością jonów w polu falowym T: podstawowe procedury eksperymentalne w analizie kompleksów białkowych

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest określenie ogólnego kształtu kompleksów białkowych. Osiąga się to poprzez pozyskanie danych z mobilności jonowej w spektrometrii mas dla jonów kompleksów białkowych i pomiar wartości czasu dryfu dla każdego stanu ładunku. W drugim kroku waliduje się warunki eksperymentalne, aby zapewnić pomiary mobilności natywnych struktur białkowych.

Następnie zmierzone wartości czasu dryfu koreluje się z powierzchniami przekroju. Wyniki pozwalają wyznaczyć wartości przekroju czynnego zderzeń białek lub kompleksów białkowych o nieznanych strukturach trójwymiarowych. Informacje te dostarczają wskazówek na temat ich ogólnego kształtu, upakowania podjednostek oraz topologii.

Witajcie, jestem Isaac Leski z Laboratorium Mic, Katedry Chemii Biologicznej w Instytucie Nauk Weizmanna, a ja jestem Naam Kirschenbaum, również z laboratorium Mic. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę pomiaru przekroju czynnego zderzeń kompleksów białkowych przy użyciu hybrydowego spektrometru mas i instrumentów do mobilności jonowej. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania ogólnego kształtu i organizacji przestrzennej kompleksów białkowych.

Zacznijmy zatem. Niniejsza procedura koncentruje się na analizie kompleksów białkowych metodą mobilności jonów żelaza w spektrometrii mas, czyli analizie IMM MS. Kroki przygotowania próbek, kalibracja instrumentu oraz procedury optymalizacji MS i tandemowej MS zostały przedstawione w powiązanym protokole JO.

Ogólnie protokół ten zakłada wykorzystanie niskich mikromolarnych stężeń kompleksu w buforze lotnym, takim jak octan amonu. Biorąc pod uwagę, że na jedną kapilarę nanoprzepływową zużywa się od 1 do 2 µL, należy przygotować minimum 10 do 20 µL, aby umożliwić optymalizację warunków MS. Aby rozpocząć tę procedurę, należy ustawić synap IMMS z falą bieżącą (traveling wave) lub T-wave w tryb pracy mobility tof, w którym wartości tri wave oraz ciśnienia są automatycznie ustawiane zarówno dla IM, jak i dla rozdziału jonów w czasie przelotu (time of flight), wybrać akwizycję jonów dodatnich oraz tryb V, ustalający ścieżkę jonów przez tubę przelotową i reflektor; w tym momencie należy włączyć wszystkie gazy.

Azot jest wykorzystywany do separacji w IM, a argon w obszarach pułapki i transferu. Rekomendowane wartości początkowe to przepływ gazu 24 milliliters per minute dla urządzenia IMS oraz 1,5 milliliters per minute dla obszaru pułapki. Następnie należy ustawić zakres akwizycji stosunku ładunku do masy dla nieznanego kompleksu białkowego.

Na początku należy zastosować szeroki zakres mas, który następnie można zredukować do pożądanych wartości, odpowiednio dostosowując profil MS. Aby uzyskać maksymalną wydajność transmisji dla dużych kompleksów, zakres mas akwizycji powinien zostać ustawiony od 1030 do 2000 m/z, a profil MS na auto. W przeciwnym razie profil można ustawić zgodnie z przedstawionym schematem.

Sprawdź ustawienia RF i w razie potrzeby dostosuj je do wartości odpowiednich dla dużych kompleksów białkowych, zgodnie z instrukcją. Następnie wprowadź próbkę, przyłóż napięcie kapilarne i niskie ciśnienie przepływu nano. Po zainicjowaniu rozpylania spróbuj zredukować ciśnienie przepływu nano do wartości minimalnej.

Dodatkowo należy dostosować pozycję kapilary względem stożka oraz zmodyfikować parametry akwizycji MS, aby uzyskać dobrze rozdzielone widmo MS. Należy zoptymalizować gradient ciśnienia wzdłuż urządzenia i stożka próbkowania, a także ustawienia potencjału pułapki bias stożka ekstrakcyjnego i transferu, zgodnie ze szczegółami zawartymi w powiązanym protokole JoVE. Chociaż parametry te zależą od próbki, poniżej przedstawiono warunki zastosowane do pozyskiwania widm MS dla różnych mas żelaza, od peptydów po kompleksy białkowe.

Duże jony wymagają wyższych energii kolizyjnych i wyższego napięcia bias. W przypadku analizy dużych kompleksów białkowych zaleca się również zwiększenie ciśnienia wstecznego, aby zminimalizować aktywację kompleksu. Należy spróbować stopniowo obniżać o około 10 V napięcia ekstrakcji stożka próbkowego (sample cone), pułapki stożkowej (cone trap) oraz napięcie bias, dopóki pozycja piku pozostaje niezmieniona.

Po uzyskaniu optymalnego widma masowego, podczas analizy kompleksów białkowych należy dostosować czas dryfu lub profil IM. Optymalne warunki dla pomiarów masy oraz mobilności są często ze sobą sprzeczne. Dlatego ważne jest znalezienie odpowiedniej równowagi pomiędzy nimi.

Ogólnie rzecz biorąc, wykres mobilności żelaza powinien zostać zoptymalizowany w taki sposób, aby piki były rozłożone w całym zakresie czasu dryfu, a profil piku był gładki. W przypadku zbliżania się do rozkładu gaussianowskiego, znacząca asymetria piku może być związana ze słabą separacją wielu konformacji. Prędkość fali T, wysokość fali T oraz szybkość przepływu gazu IMS mogą być dostrajane w celu optymalizacji separacji mobilności. Zwiększenie prędkości fali T poszerza profil rozkładu czasu dryfu.

Podczas gdy zwiększenie wartości amplitudy fali T powoduje jej analogie zawężenie, zwiększenie przepływu gazu IMS, zaczynając od minimum 10 milliliters per minute, przesuwa profil czasu dryfu w stronę wyższych wartości w celu optymalizacji widma mobilności jonów. Aby zoptymalizować widmo, ustalając dwie z trzech zmiennych i optymalizując trzecią, ustaw prędkość fali T na 250 meters per second, a przepływ gazu na 24 milliliters per minute. Następnie, jako punkt wyjścia, ustaw amplitudę na trzy volts i stopniowo zwiększaj ją w interwałach jednego volta.

W przypadku stosowania wysokich napięć polaryzacji zaleca się obniżenie ciśnienia gazu w IMS, co pozwoli na zmniejszenie napięcia polaryzacji. W konsekwencji ograniczone zostanie pobudzenie i dysocjacja kompleksów. W warunkach nieoptymalnych może wystąpić efekt „rollover”, objawiający się jako identyczny pik w pierwszej części widma czasów dryfu oraz na jego krawędzi spływowej.

Gdy jony nie przechodzą przez urządzenie IAM, ich droga może w rzeczywistości trwać dłużej niż czas wymagany do uwolnienia kolejnego pakietu jonów do celi mobilności. W rezultacie nowa grupa jonów zostaje uwolniona z obszaru pułapki, zanim poprzedni pakiet dotrze do obszaru wypychacza. Aby wyeliminować ten artefakt, należy zwiększyć amplitudę fali T oraz zmniejszyć prędkość fali T i ciśnienie IMS.

Dodatkowo można dostosować czas uwalniania z pułapki. Ponadto ważne jest sprawdzenie, czy wysokość fali przenoszenia T jest ustawiona na co najmniej pięć woltów. Służy to również zapobieganiu wyciekowi jonów w kierunku celi IMS.

Wysokość pułapki mobilności powinna być utrzymywana na maksymalnym poziomie. Niska prędkość i wysoka amplituda fal przenoszenia T mogą prowadzić do powstawania zmarszczek w profilu rozkładu czasu dryfu. Artefakt ten występuje, gdy separacja jonów ze względu na mobilność nie jest utrzymana w obszarach przenoszenia i obszarach trudnych, co wynika z częściowej synchronizacji pomiędzy częstotliwością wypychania a prędkością fal przenoszenia T.

Aby wyeliminować ten efekt, należy skorygować czas wypychania (pusher time) lub prędkość fali T transferu. Ponieważ częstotliwość wypychania jest powiązana z zakresem mas, artefakt ten może pojawić się ponownie po zmianie tego parametru.

Wysokość zespołu T wywiera niewielki wpływ, choć jego zmniejszenie może również pomóc w eliminacji zmarszczek. Po optymalizacji wyżej wymienionych parametrów można zebrać dane IMMS, aby uzyskać wysoką rozdzielczość.

Kompleksy białkowe MS.Peaks są często aktywowane wewnątrz spektrometru mas, aby wspomóc usuwanie resztkowej wody i składników buforu. Jeśli jednak energia aktywacji zostanie zwiększona powyżej wartości progowej, może dojść do częściowego rozfałdowania z utworzeniem wielu stanów pośrednich, które prawdopodobnie nie odpowiadają strukturze natywnej w roztworze. W rezultacie szczyt czasu dryftu może ulec przesunięciu i poszerzeniu, co odzwierciedla heterogenną populację struktur rozfałdowanych.

Aby uzyskać dane dotyczące czasu dryftu spójne ze strukturami w fazie roztworu, niezbędna jest staranna kontrola napięć stosowanych do przyspieszania jonów przed rozdziałem IM; należy zatem stopniowo zwiększać napięcie kapilary i stożka, monitorując wpływ tego procesu na spektrum czasu dryftu. Ponadto, w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości MS, zaleca się zwiększanie napięcia transferowego zamiast napięcia pułapki. Urządzenie IM jest umieszczone w pierwszej kolejności, a następnie następuje obszar transferowy i analizator TOF.

Ponieważ aktywacja następuje po pomiarze IM, nie wpływa ona na wyniki IM, natomiast dokładność MS może zostać zwiększona, aby zapewnić zbieranie danych w warunkach utrzymujących natywną strukturę kompleksu; dlatego ważne jest gromadzenie danych w szerokim zakresie warunków eksperymentalnych i roztworowych, zamiast polegania na pojedynczym, zoptymalizowanym zestawie parametrów. Z tego powodu należy stopniowo zwiększać napięcie kolizyjne pułapki i pozyskiwać dane w odstępach 10 V, monitorując jednocześnie wpływ na profil mobilności jonów żelaza. Na koniec, aby zidentyfikować konformacje rozfałdowane i ocenić pozyskane dane, należy wywołać manualnie dysocjację kompleksu białkowego poprzez miareczkowanie próbki kwasem octowym w zakresie pH od 2 do 7 i zapisać dane, a następnie przejść do analizy danych w systemie T-wave IMS, wyznaczając przekroje poprzeczne metodą kalibracji czasu dryftu z wykorzystaniem białek kalibracyjnych o znanych wartościach przekroju poprzecznego.

W pierwszej kolejności należy przygotować zdenaturowane roztwory białek kalibracyjnych o stężeniu 10 µM każdy. Należy wykorzystać koniowy cytochrom C, mioglobinę z serca konia oraz wołową ubikwitynę w wodzie, metanolu i kwasie octowym w stosunku objętościowym 49:49:0,2. Następnie należy zebrać dane IMMS dla białek kalibracyjnych w dokładnie tych samych warunkach instrumentalnych, które zastosowano dla białka docelowego lub kompleksu białkowego, utrzymując wszystkie wartości napięć i ciśnień na identycznym poziomie w celu zachowania ustawień rozdziału IM.

Po pozyskaniu danych wyodrębnij eksperymentalną wartość czasu dryfu dla każdego stanu naładowania. W celu korekty czasów dryfu T'D zastosuj następujące równanie, w którym MOVZ to główny stosunek masy do ładunku obserwowanej jonu, a C to współczynnik opóźnienia ulepszonego cyklu pracy (EDC). Jego wartość, zazwyczaj mieszcząca się w przedziale od 1,4 do 1,6, jest zależna od instrumentu.

Wartość EDC jest wskazana w ustawieniach akwizycji systemu one (one acquisition settings), w zakładce konfiguracji akwizycji (one acquisition setup); należy skorygować każdy z przekrojów poprzecznych kalibru zarówno dla stanu ładunku żelaza, jak i masy zredukowanej. Gdzie omega C jest skorygowanym przekrojem poprzecznym, omega to przekrój poprzeczny z literatury, Z to stan ładunku żelaza, M to masa cząsteczkowa jonu łańcucha, a MG to masa cząsteczkowa żelaza.

Gaz tła, którym zazwyczaj jest azot, plop thelan of T prime D przeciwko thelan of omega C. Powstała krzywa odpowiada następującemu równaniu. Parametry X i A można wyznaczyć poprzez dopasowanie wykresu do zależności liniowej. Nachylenie X odpowiada wykładniczemu czynnikowi proporcjonalności, a A reprezentuje wyznaczoną stałą dopasowania.

Oblicz współczynnik korelacji dopasowania R kwadrat. Akceptowalne wartości R kwadrat są większe niż 0,95. Niższa wartość współczynnika korelacji może wynikać z niepełnego rozfałdowania białka lub starzenia się próbki.

Różnice w warunkach eksperymentalnych stosowanych dla białek o różnej masie, szum widma i niepełne przetwarzanie danych lub błędy obliczeniowe. Skoryguj czas dryfu ca, korzystając z wyznaczonego czynnika wykładniczego X, i zweryfikuj obliczenia, wykreślając ponownie omega C w funkcji T prime D. Zdefiniuj ponownie współczynnik korelacji. Należy spodziewać się wartości wyższych niż 0,95. Analogicznie do kroków opisanych wcześniej, skoryguj zmierzony czas dryfu białka docelowego lub kompleksu białkowego i skalibruj czas dryfu białka docelowego lub kompleksu białkowego, korzystając z obliczonego czynnika wykładniczego X. Oblicz omega białka docelowego lub kompleksu białkowego, korzystając z wyznaczonej dopasowaniem stałej A, gdzie omega równa się a TD. Powtórz te kroki dla każdego z warunków eksperymentalnych.

Przy określaniu przekroju poprzecznego nieznanego białka lub kompleksu białkowego zaleca się, aby każdy eksperyment powtórzyć co najmniej trzykrotnie, a następnie wyznaczyć odchylenie standardowe tych pomiarów potrójnych po ustaleniu wartości przekroju czynnego zderzeń. W celu przewidzenia topologii lub układu kompleksu stosuje się podejścia modelowe. Odbywa się to poprzez dopasowanie eksperymentalnych wartości przekroju czynnego zderzeń do wartości Omega obliczonych in silico na podstawie wygenerowanych struktur modelowych; ogólnie dziedzina ta znajduje się wciąż w początkowej fazie i wymaga dalszego rozwoju, aby podejście to stało się uniwersalne i możliwe do zastosowania w szerokim zakresie kompleksów.

Przedstawiono tutaj reprezentację powierzchniową tetramerycznej formy hemoglobiny bydlęcej. Kompleks hemoglobiny, pełniący funkcję transportera tlenu, może służyć jako przykład dla wspomnianego wyżej podejścia. Hemoglobina jest tetramerycznym kompleksem białkowym składającym się z dwóch podjednostek alfa i dwóch podjednostek beta, odpowiednio w kolorze niebieskim i czerwonym, które tworzą dimer dimerów alfa-beta.

Tutaj przedstawiono widmo IMMS hemoglobiny. Uzyskane widmo IM ms kompleksu wykazuje główny rozkład serii ładunków odpowiadający nienaruszonemu kompleksowi oraz mniejsze serie ładunków, które odpowiadają masom dimeru alfa-beta oraz monomerycznych podjednostek alfa i beta. Tutaj pokazano teoretyczne i zmierzone wartości CCS dla różnych form hemoglobiny.

Wartości czasu dryfu uzyskane dla kilku stanów ładunkowych form dimerycznych i tetramerycznych wykorzystano do obliczenia wartości omega. Zostały one porównane z wartościami teoretycznymi. Przyjęto, że kompleks tetrameryczny posiada trzy możliwości asocjacji: w formie cyklicznej, dihedralnej lub w postaci upakowań łańcuchowych.

Obliczając wzrost wartości omega przy przejściu z dimeru do tetrameru, można przewidzieć organizację strukturalną. Poprzednie badania oraz nasze własne eksperymenty wykazały silną korelację między zmierzoną wartością ccss a powierzchniami białek wyznaczonymi na podstawie danych z krystalografii strukturalnej. Korelacja ta może zostać wykorzystana do obliczenia oczekiwanego wzrostu powierzchni tetrameru w porównaniu do dimeru dla różnych form upakowania.

Osiąga się to poprzez traktowanie każdej podjednostki jako obiektu asferycznego. Złożenie w formie łańcucha zwiększy CCS tetrameru około dwukrotnie, podczas gdy upakowanie typu C4 lub D2 spowoduje wzrost odpowiednio o około 1,5 i 1,67. Obliczony stosunek zmierzonych wartości CCS formy tetramerycznej i DME hemoglobiny wyniósł 1,57 ± 0,03.

Liczba ta obrazuje, że struktura natywna nie jest zorganizowana liniowo, lecz ułożona w bardziej zwartą formę, albo jako tetramer cykliczny, albo dwumianowy. Przy powtórzeniu tego samego obliczenia na rozstrzygniętej strukturze krystalicznej hemoglobiny stosunek powierzchni tetrameru do formy DME wyniósł 1,63, co odpowiada symetrii D2. Oczywiście model geometryczny ten został uproszczony, a podjednostki białkowe nie są jedynie sferyczne.

Niemniej jednak, obliczenie to demonstruje obiecujący potencjał IMMS w ujawnianiu upakowania kompleksów o nieznanych strukturach wysokiej rozdzielczości. Przedstawiłem właśnie sposób pomiaru czasu dryfu białka oraz kompleksów białkowych, a także sposób obliczania wartości ich przekroju czynnego zderzeń. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pozyskać dane IMMS dla białek kalibracyjnych w dokładnie tych samych warunkach, których użyto dla białka docelowego lub kompleksów białkowych.

Ponadto stanowczo zalecamy powtórzenie tych eksperymentów co najmniej trzykrotnie oraz wyznaczenie odchylenia standardowego dla tych pomiarów w trzech powtórzeniach. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.