Analiza ekspresji genów u opiętka jesionowego (Agrilus planipennis) z wykorzystaniem ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest analiza ekspresji genów w tkankach i stadiach rozwojowych jesionowca szmaragdowego za pomocą ilościowej PCR. Jest to realizowane poprzez sekcję tkanek larwalnych i kategoryzację stadiów rozwojowych. W drugim kroku ekstrahuje się RNA z tkanek i stadiów rozwojowych przy użyciu odczynnika trizol, który służy następnie jako matryca do wygenerowania pierwszej nici cDNA; po syntezie pierwszej nici cDNA przeprowadza się ilościową RT-PCR.

Uzyskano wyniki wykazujące różnicową ekspresję genu docelowego w różnych tkankach larwalnych i stadiach rozwojowych na podstawie pełnych danych o zmianach uzyskanych z wartości progowych cyklu po amplifikacjach ilościowych R-T-P-C-R. Cześć, jestem Prakash Mi, kierownik tego laboratorium w Katedrze Entomologii na Uniwersytecie Stanowym Ohio.

W moim laboratorium skupiamy się głównie na genomicznych i molekularnych aspektach interakcji między jesionem a szafranikiem jesionowym. Szafranik jesionowy, znany jako EAB, to egzotyczny gatunek inwazyjny pochodzący z Chin, który zagraża samemu istnieniu populacji jesionów w całej Ameryce Północnej. Dzisiaj przedstawimy protokół analizy ekspresji genów u EAB z wykorzystaniem qPCR, czyli ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym.

W protokole tym będą uczestniczyć następujące osoby z zespołu laboratoryjnego: Swapna pri ou, która przeprowadzi sekcje wal, a następnie Bin Bandari zaprezentuje izolację RNA. Na koniec Lauren Rivera Vega zajmie się analizą QPC. Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium również do badania ekspresji genów jesionu.

Zacznijmy zatem. Przed rozpoczęciem tej procedury umieść larwy opiętka jesionu (emerald ash B) na wilgotnym papierze tkankowym. Do momentu przeprowadzenia sekcji przechowuj świeżo przygotowany 1x roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) w lodzie, aby bufor pozostał zimny przez cały czas trwania sekcji.

Na początku unieruchom larwy EAB na płytce do sekcji za pomocą cienkich szpilek sekcyjnych. Następnie dodaj do płytki do sekcji zimny roztwór 1x PBS. W pierwszej kolejności odetnij głowy larw za pomocą cienkich nożyczek sekcyjnych.

Następnie, za pomocą pęsety zegarmistrzowskiej, odetnij ostatni segment odwłoka larw. Oddziel kutykulę od tułowia larwy, a następnie wykonaj nacięcie wzdłuż tułowia za pomocą nożyczek. Należy uważać, aby nie przerwać ciągłości przewodu pokarmowego.

Podczas wykonywania nacięcia należy ostrożnie oddzielić tkankę jelita środkowego od pozostałych tkanek, takich jak ciała tłuszczowe i tkanka łączna. Następnie tkankę należy wypłukać w świeżym buforze 1xPBS, aby upewnić się, że nie występuje zanieczyszczenie ciałami tłuszczowymi. Jelito środkowe należy przenieść do 500 µl schłodzonego odczynnika TRIzol w probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml.

Następnie za pomocą pęsety wyizoluj tkankę ciała tłuszczowego i przenieś ją do probówki typu eppendorf o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 µl schłodzonego odczynnika triol. Na koniec wyizoluj tkankę kutykuli z kadłuba larwy, zdrapując wszelkie przylegające tkanki. Należy przy tym uważać, aby nie naruszyć integralności tkanki.

Przepłucz wyizolowaną tkankę kutykuli w świeżym buforze PBS i przenieś ją do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 µL schłodzonego odczynnika triazolowego. Wyizolowaną kutykulę ciała tłuszczowego oraz tkanki jelita środkowego można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu ekstrakcji RNA. W ramach przygotowania do ekstrakcji RNA, posegreguj poszczególne próbki EAB zgodnie z etapami rozwoju.

Etapy te obejmują pierwszy, drugi, trzeci i czwarty w stadium gwiazdy, PrepU oraz u osobników dorosłych. Aby rozpocząć ekstrakcję RNA, należy najpierw użyć plastikowych tłuczków do homogenizacji tkanek w odczynniku triol w probówkach typu einor o pojemności 1,5 milliliter. Po homogenizacji należy uzupełnić całkowitą objętość każdej próbki do 1 milliliter za pomocą odczynnika triol.

W przypadku stadiów rozwojowych, homogenizować całe zwierzę w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka. Następnie dodać alikwot homogenatu do jednego mililitra triolu. Inkubować probówki z próbkami zawierającymi jeden mililitr triolu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji do każdej probówki należy niezwłocznie dodać 200 µL chloroformu. Probówki należy energicznie potrząsać przez około 15 sekund. Następnie probówki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez dodatkowe dwie do trzech minut.

Następnie odwiruj próbki z prędkością 12 000 g przez 15 minut w temperaturze 2 °C. Po wirowaniu RNA będzie znajdować się w fazie wodnej. Objętość fazy wodnej powinna wynosić 600 µL lub 60% całkowitej objętości triolu.

Ostrożnie usuń wyłącznie fazę wodną. Obecność substancji znajdujących się poniżej fazy wodnej spowoduje zanieczyszczenie wyekstrahowanego RNA. Następnie przenieś fazę wodną do odpowiednio oznakowanej probówki einor o pojemności 1,5 mililitra.

Aby wytrącić RNA z mieszaniny fazy wodnej, należy dodać 0,5 ml izopropanolu do każdej probówki. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji probówki należy wirować z prędkością 12 000 G przez 10 minut w temperaturze 2 °C. Po wirowaniu należy usunąć S natin z probówek.

RNA znajduje się w żelowatym osadzie uformowanym na dnie probówki. Przemyć osad 75% etanolem, dodając co najmniej 1 mL 75% etanolu na każdy 1 mL próbki, a następnie wymieszać za pomocą wortexa. Następnie odwirować próbki z prędkością 7 500 G przez pięć minut w temperaturze 2 °C.

Odlej nadsącz z probówek. Ponownie odwiruj probówki w małej wirówce stołowej przez jedną minutę. Usuń resztki nadsączu z probówki za pomocą ostrożnego pipetowania.

Pozostaw probówkę otwartą i pozwól osadowi wyschnąć na powietrzu przez 5 do 10 minut. Należy uważać, aby nie przesuszyć osadu, ponieważ znacząco zmniejszy to jego rozpuszczalność po suszeniu. Ponownie zawiesić osad w węglanie dietylu lub wodzie zdejonizowanej.

Ilość wody użytej do resuspensji osadu zależy od jego wielkości. Należy użyć 50 µL wody oczyszczonej metodą dep sea w przypadku małego osadu lub 100 µL w przypadku dużego osadu. Osad należy całkowicie rozpuścić w wodzie oczyszczonej metodą dep sea, kilkakrotnie przesuwając końcówkę pipety w górę i w dół.

Po rozpuszczeniu osadu należy inkubować próbkę w temperaturze 55 °C przez 10 minut. Następnie za pomocą spektrofotometru NanoDrop należy zmierzyć stężenie każdej próbki RNA. Na koniec, dla odpowiednich próbek RNA, przeprowadza się syntezę pierwszej nici cDNA, wykorzystując system Invitrogen SuperScript First-Strand Synthesis System dla RT-PCR.

Procedurę tę można znaleźć w części pisemnej niniejszego protokołu. Aby rozpocząć projektowanie ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (Q-R-T-P-C-R), należy zaprojektować każdą starter tak, aby temperatura topnienia wynosiła 60 °C, a rozmiar produktu około 100 pz. W tym doświadczeniu jako gen docelowy wykorzystano AP par one.

Do późniejszej analizy i normalizacji danych niezbędny jest gen referencyjny lub kontrola wewnętrzna. W tym przypadku jako gen referencyjny zastosowano białko rybosomalne a P RRP one. Następnie należy przygotować szablon z nazwami próbek dla każdej studni oraz dla płytki do qPCR.

Pamiętaj o uwzględnieniu standardów dla każdego genu oraz co najmniej dwóch powtórzeń technicznych na próbkę. Następnie włącz urządzenie do qRT-PCR i wprowadź parametry cykliczności, aby skonfigurować płytkę dla urządzenia CFX 96. W pierwszej kolejności przygotuj master mix dla każdego genu w oddzielnej probówce dla każdego dołka.

Mieszanina główna (master mix) składa się z 2 µL wody wolnej od nukleaz, 4 µL Cyber Green (2,5x), 1 µL primera forward oraz 1 µL primera reverse, co daje objętość całkowitą 8 µL. Zgodnie z wcześniej przygotowanym schematem, do każdego dołka należy dodać 2 µL cDNA. Następnie do każdego dołka dodaje się 8 µL mieszaniny głównej, tak aby całkowita objętość jednej reakcji wyniosła 10 µL. Próbki należy wymieszać poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół.

Upewnij się, że na końcówce nie pozostał żaden płyn. Aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych, używaj nowej końcówki dla każdej próbki. Po przygotowaniu całej płytki należy przykryć ją taśmą optyczną.

Należy unikać dotykania taśmy, ponieważ obecność tłuszczu może wpłynąć na odczyt. Następnie należy wirować płytkę z prędkością 500 RPM przez jedną minutę, aby upewnić się, że po wirowaniu wszystkie produkty w dołkach znajdują się na dnie płytki. Należy sprawdzić, czy na dnie płytki nie ma lodu ani wody.

Na koniec umieść płytkę w urządzeniu do QR TPCR i uruchom program PCR; przedstawiono reprezentatywne wyniki dla larw EAB. Poniżej pokazano sekcję oraz QR TPCR. Sekcja larwy EAB powinna odsłonić jelito środkowe w środkowej części larwy EAB.

Środkowy jelito larwy EAB jest izolowane w sposób pokazany tutaj, przedstawiono średnie wartości ekspresji względnej lub RAV. Dla genu paratrofiny AP par one wyniki przedstawiono tutaj dla różnych tkanek larwalnych, w tym kutykuli, jelita środkowego i ciał tłuszczowych. Specyficzne dla EAB białko rybosomalne ARP one zostało użyte jako kontrola wewnętrzna do normalizacji danych uzyskanych dla badanego genu.

Wyznaczono względną krotność zmiany poziomu ekspresji genu AP par one dla różnych tkanek larwalnych. Tkanka kutykuli wykazała najniższą ekspresję i została zatem przyjęta jako próbka kalibracyjna dla średniej wartości RVs dla AP Perry one w różnych stadiach rozwojowych EAB, w tym w pierwszym, drugim, trzecim i czwartym stadium larwalnym (LAR) gwiazd.

Poziomy PrepU i dorosłych określono, wykorzystując aprp one jako kontrolę wewnętrzną do normalizacji danych. Określono względną krotność zmiany AP Perry one dla różnych etapów rozwojowych. W tym przypadku próbka PrepU wykazała najniższy poziom mRNA i została zatem przyjęta jako kalibrator.

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzania sekcji bocznych oraz następującej po niej analizy ekspresji genów w tkankach bocznych, a także w różnych stadiach rozwojowych Emeral ra, przy użyciu ilościowej R-T-P-C-R podczas realizacji tej procedury. Należy zachować ostrożność podczas sekcji, aby nie doprowadzić do zanieczyszczenia krzyżowego próbek tkanek. Należy również zachować staranność podczas przeprowadzania Q-R-T-P-C-R, aby pipetować odpowiednie próbki do właściwych studzienek PCR.

To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie naszego filmu i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.