Profilowanie proteomu redoks grup tiolowych z wykorzystaniem spektrometrii mas z tagowaniem izotopowym

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zaobserwowanie wpływu Pseudomonas syringae pv. tomato na białka regulowane przez procesy redoks w roślinach pomidora. W pierwszej kolejności należy zaszczepić rośliny pomidora szczepem Pseudomonas syringae pv. tomato, aby wywołać infekcję patogenem oraz odpowiedź białkową. Następnie należy przeprowadzić barwienie z użyciem DAB, aby zaobserwować zmiany w poziomie reaktywnych form tlenu.

Następnie przeprowadź znakowanie cystein metodą TMT, aby zbadać cysteiny regulowane redoks w białkach. Uzyskane wyniki pozwalają zmierzyć różnice między próbkami badanymi a kontrolnymi. Cześć, nazywam się Chen i pochodzę z wydziału biologii oraz centrum proteomiki na Uniwersytecie Florydy.

Przewagą naszego znakowania CTMT nad istniejącymi metodami, takimi jak znakowanie płetw powłoką izotopową, znane również jako ASCA, jest możliwość multipleksowania podczas analizy białek responsywnych na potencjał redoks na dużą skalę. Choć niniejsza demonstracja dostarczy informacji na temat białek regulowanych redoks u pomidora w odpowiedzi na infekcję patogenem, eksperyment ten można zastosować do innych systemów, takich jak joof, myszy cu, inne rośliny oraz w celu kontroli warunków stresowych. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas po zaobserwowaniu wyraźnych różnic między eksperymentami ICAD, wynikających z dostępności tylko dwóch znaczników.

Demonstracja VIR tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy znakowania i wzbogacania są trudne do opanowania. Należy zminimalizować różnice eksperymentalne między znakowanymi próbkami i ograniczyć usuwanie regionów, aby zapewnić efektywne znakowanie. Zacznijmy. Wyhoduj dwie przesadzone sadzonki pomidora o podobnej wielkości w doniczkach o średnicy czterech cali w celu przygotowania kultury inokulum.

Warstwa bakterii Pseudomonas syringae na płytce KBM. Zeskrob bakterie do 20 mililitrów wody i przygotuj inokulum bakteryjne o stężeniu około 10⁶ jednostek tworzących kolonie na mililitr. W jednym litrze buforu do inokulacji zanurz rośliny w wieku czterech tygodni w roztworze inokulacyjnym z bakteriami na 30 sekund.

Następnie niezwłocznie przykryć przezroczystymi plastikowymi workami. Po preferowanym czasie inokulacji zebrać w pełni rozwinięty liść, umieścić go stroną epidermalną do góry w roztworze barwnika DAB o stężeniu 1 mg/ml i poddać infiltracji próżniowej przez 15 minut. Następnie inkubować liście w ciemności w temperaturze pokojowej przez noc.

Następnie gotuj zbarwione liście w 95% ethanol przez 10 minut, a następnie przechowuj w 75% ethanol. Rozetrzyj zebrane liście w ciekłym azocie w moździerzu, aż do uzyskania drobnego proszku. Następnie przeprowadź ekstrakcję fenolu zgodnie z opisem w towarzyszącym tekście.

Następnie wytrącić białka ekstrahowane fenolem, dodając pięć objętości zimowego 0,1 molarnego octanu amonu w 100% metanolu. Zebrać białka poprzez wirowanie i przeprowadzić przemycia osadu. Następnie zawiesić próbki w 1,5 ml zimnego, 70% etanolu i przenieść do probówki do mikrocentryfugi o pojemności dwóch ml.

Po wirowaniu odrzuć nadsącz etanolowy i krótko wysusz osad w wirówce próżniowej (speed vac). Próbki rozpuść w denaturującym buforze do ekstrakcji białek; po odwirowaniu i uformowaniu osadu zbierz nadsącz i zmierz stężenie białka zgodnie z instrukcją producenta. W przypadku każdego z sześciu znaczników masowych zacznij od 100 µg próbki białka w równej objętości świeżo przygotowanego, 200 mM buforu do alkilacji jodku acetamidu, aby zablokować wolne grupy tiolowe; inkubuj w 37 °C przez godzinę. Następnie, aby wytrącić białka, dodaj 1 ml zimnego 80% acetonu i pozostaw w temperaturze -20 °C na noc.

Odwirować białko w celu uzyskania osadu, a następnie przeprowadzić trzy przemycia 80% acetonem. Po wysuszeniu próbek na powietrzu na lodzie, ponownie zawiesić osad w 50 µL buforu lizującego. Następnie, aby zredukować mostki dwusiarczkowe, dodać 0,5 µL 100 mM TCEP i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Rozpuść znaczniki, dodając 20 µL acetonitrylu do probówek z odczynnikiem. Wymieszaj w wstrząsarze wirówkowym i odwiruj. Następnie, aby usunąć nadmiar TCEP, nałóż 50 µL próbki na kolumnę MicroCon 3 kDa. Dodaj 50 µL buforu lizującego i wiruj przez 15 minut przy 10 000 ×g i 4 °C.

Aby pobrać próbkę, należy wyjąć kolumnę, odwrócić ją nad czystą probówką i odwirować. W razie potrzeby należy sprawdzić pH próbki. Dostosować pH do wartości między siedem a osiem za pomocą jednomolowego kwasu solnego.

Dodaj pięć µL odczynnika TMT do cystein i inkubuj reakcję przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, połącz próbki i dodaj taką samą objętość buforu do lizy próbek, gotuj przez pięć minut i rozdziel na gotowym żelu poliakrylamidowym 12%. Po trzykrotnym przemyciu żelu wodą filtrowaną barw go błękitem Coomassie przez godzinę i odbarwiaj przez noc w wodzie, opierając się na stężeniach pręg proteinowych. Podziel każdą ścieżkę żelu na 12 frakcji. Potnij każdą frakcję na fragmenty o wielkości 1 mm i umieść w probówce o pojemności 1,5 mL.

Całkowicie zanurz kawałki żelu w 0,1 molarnym wodorowęglanie amonu w 50% acetonitrylu. Następnie przykryj kawałki 100% acetonitrylem na 15 minut. Odlej ciecz i wysusz kawałki za pomocą wirówki próżniowej (speed vac).

Następnie należy dodać taką samą objętość roztworu trypsyny i pozostawić na lodzie w celu rehydratacji. Następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 do 16 godzin w celu trawienia trypsyną. Na koniec należy usunąć ciekawy ekstrakt białkowy z inkubowanych próbek.

Zatrzymać reakcję i usunąć pozostałości trawienia białek, pokrywając fragmenty żelu roztworem 5% kwasu mrówkowego w 50% acetonitrylu. Następnie wstrząsać fragmentami żelu przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść nadsącz do probówek z próbkami ekstrahowanych białek po przeprowadzeniu dwóch kolejnych ekstrakcji.

Próbki należy wysuszyć w wirówce próżniowej (speed vac) w probówkach o pojemności 0.5 ml. Przygotować 50% zawiesinę żywicy anti-TMT w buforze TBS w stężeniu proporcjonalnym do intensywności odpowiedniego prążka białkowego. Żywicę należy przemyć trzykrotnie objętością kolumny jednokrotnego buforu TBS, a następnie dodać 200 µl TBS do każdej próbki.

Następnie przenieść na żywicę anty-TMT i inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, a następnie wytrząsać przez noc w temperaturze 4 °C. Nałożyć każdą próbkę na kolumnę. Przeprowadzić płukanie kolumny za pomocą porcji po 200 µl.

Następnie każdą próbkę wymyj trzykrotnie, używając 200 µL 50% buforu elucyjnego, a następnie wysusz w próżni. Próbki resuspenduj w 12 µL 3% acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym i wstrzyknij 5 µL bezpośrednio na kolumnę HPLC. Eluuj peptydy, stosując gradient rosnącego stężenia acetonitrylu, zgodnie ze szczegółami opisanymi w tekście towarzyszącym.

Zastosuj spektrometrię mas do wykrywania peptydów w schemacie analizy top two by three. Rozpocznij od pojedynczego etapu ms. Następnie uzyskaj trzy widma Ms.Ms z fragmentacją poprzez dysocjację w pułapce kollinearnej przy wyższej energii (HCD), a następnie trzy.

Spektrometria mas tandemowa (Ms.MS) z dysocjacją indukowaną zderzeniami w celu identyfikacji białek. Analiza danych ze spektrometrii mas z wykorzystaniem rozgałęzionego przepływu pracy. Implementacja kwantyfikatora żelaza raportującego w celu określenia stosunku ilościowego.

Przetwórz również widmo MSM MS przez węzły selektora widm, normalizatora widm i grupowania widm, a następnie przeprowadź zapytanie o dane w wyszukiwarce SeaQuest. Na tym zdjęciu przedstawiono przykłady liścia kontrolnej rośliny pomidora po lewej stronie oraz liścia inokulowanego bakterią Pseudomonas po prawej stronie po zabarwieniu liści przy użyciu DAB. Proces barwienia DES pozwala na wykazanie w tkance liścia obecności reaktywnych form tlenu za pomocą barwienia histochemicznego.

Zgodnie z oczekiwaniami, kontrola nie wykazuje istotnego barwienia, podczas gdy liście traktowane Pseudomonas barwią się dodatnio na produkcję nadtlenku wodoru. Ten przykład przedstawia dane wyjściowe z analizy proteomu; pole powierzchni piku białka regulowanego różnicowo w zależności od stanu redoks dla każdej próbki umożliwia kwantyfikację absolutną. Pole powierzchni piku między próbkami kontrolnymi a inokulowanymi wskazuje ilości względne.

W tym przypadku regulacja redoks białka między próbką kontrolną a inokulowaną jest podobna. Piki o zbliżonej intensywności sugerują obecność mostków dwusiarczkowych, które nie są regulowane zmianą traktowania. Po opanowaniu techniki ta metoda może być prawidłowo wykonywana w ciągu jednego tygodnia.

Należy pamiętać o utrzymywaniu próbek w niskiej temperaturze oraz o uporządkowaniu etykiet. Podczas pracy z fenolem należy zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie rękawic ochronnych i praca w dygestorium zgodnie z niniejszą procedurą. W celu określenia innych modyfikacji systemowych, takich jak kwas onikowy i symulacja glutenu, można przeprowadzić dodatkowe pomiary, na przykład specyficzną analizę modyfikacji potranslacyjnych za pomocą spektrometrii mas.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać pełną wiedzę na temat przeprowadzania aktywacji DIB standing CTMD oraz kwalifikacji redox 16.