Badanie wpływu sztywności macierzy na funkcje komórkowe z wykorzystaniem hydrożeli na bazie akrylamidu

Celem jest modelowanie podatności tkanek in vivo przy użyciu hydrożeli akryloamidowych. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie reaktywnych szkiełek nakrywkowych dolnych oraz silikonizowanych szkiełek nakrywkowych górnych. Drugim krokiem procedury jest wylanie i utworzenie hydrożeli akryloamidowych.

Trzecim krokiem procedury jest sieciowanie wybranego białka macierzy zewnątrzkomórkowej z hydrożelem. Ostatnim etapem procedury jest inkubacja i analiza komórek. W rezultacie można uzyskać dane pokazujące, w jaki sposób zmienna sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej in vitro reguluje zachowanie komórek, co potwierdza analiza z wykorzystaniem mikroskopii immunofluorescencyjnej, ilościowego PCR w czasie rzeczywistym oraz techniki western blotting.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę otrzymywania i wykorzystania hydrożeli akryloamidowych. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać, w jaki sposób sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej reguluje morfologię, sygnalizację i proliferację komórek. Zatem zacznijmy.

Procedurę należy rozpocząć od przygotowania reaktywnych szkiełek nakrywkowych. Najpierw należy nałożyć warstwę parafilmu na dolną połowę 150 milimetrowej szalki Petriego. Następnie należy przenieść do dziewięciu autoklawowanych szkiełek nakrywkowych o średnicy 25 milimetrów na parafilm i przykryć je 1 mililitrem 0,1 molarnego wodorotlenku sodu.

Inkubuj szkiełka podstawowe przez trzy minuty. Po inkubacji odessij wodorotlenek sodu za pomocą linii próżniowej, pracując w dygestorium. Pipetuj 0,5 ml 3-aminopropylotrimetylosilanu (3-APTMS) na każde szkiełko. Inkubuj szkiełka przez trzy minuty, a następnie odessij 3-APTMS. Zachowaj ostrożność i nie inkubuj zbyt długo, aby uniknąć powstania piany na szkiełku.

Kolejne etapy po obróbce. Przepłucz szkiełka nakrywkowe raz 20 mililitrami wody dejonizowanej w tej samej szalce. Wyjmij szkiełka nakrywkowe z szalki za pomocą pęsety zakrzywionej i przenieś je stroną poddaną obróbce do góry do nowej szalki o średnicy 150 milimetrów.

Następnie ponownie przemyj szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną i umieść je na kołysarce na 10 minut. Po inkubacji usuń wodę i przemyj szkiełka dodatkowo dwa razy. Bardzo ważne jest całkowite usunięcie APTMS, aby nie zareagował on z glutaraldehydem i nie pozostawił mętnego białego osadu na 10 minut przed użyciem glutaraldehydu.

Za pomocą zakrzywionej pęsety przenieś szkiełka nakrywkowe do czystej szalki wyłożonej paramem i odessij pozostały płyn za pomocą linii próżniowej, a następnie całkowicie pokryj każde szkiełko nakrywkowe 0,5 milliliters 0,5% glutaraldehydu w sterylnej wodzie dejonizowanej, aby przeprowadzić sieciowanie trzech A-P-T-M-S i żelu poliakrylamidowego. Inkubuj szkiełka nakrywkowe przez 30 minutes w dygestorium. Następnie odessij glutaraldehyd i ponownie przemyj szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną.

Następnie całkowicie wysuszyć szkiełka nakrywkowe. Przenieść nowe szkiełka nakrywkowe do probówki Falcon o pojemności 50 ml zawierającej 10% roztwór surface seal w chloroformie i inkubować w ruchu kołyszącym przez co najmniej 10 minut. Odlać roztwór surface seal i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.

Połóż szkiełka nakrywkowe na chusteczkach Kim wipes w komorze z laminarnym przepływem powietrza, w której będą przygotowywane hydrożele, aby rozpocząć proces ich przygotowania. Używając pęsety zakrzywionej, przenieś szkiełka nakrywkowe stroną reaktywną do góry na arkusz paraflemonu przyklejony taśmą do powierzchni komory. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe przylegają płasko do powierzchni paraflemonu.

Następnie należy przygotować nasycony roztwór NHS w toluenie, rozpuszczając niewielką ilość NHS w odpowiedniej ilości toluenu. W przypadku konkretnych eksperymentów dodawaj małe ilości NHS, aż przestanie się ona rozpuszczać. Nasycony roztwór jest zazwyczaj mętny i różowy.

Następnie przygotować akrylamid, BIS-akrylamid, wodę oraz PS, aby uzyskać pożądane stężenie procentowe akrylamidu. Dodać odczynniki do probówek mikrocentryfużkowych zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Następnie dodawać po jednej alikwocie na raz.

Dodać NHS oraz TM me. Krótko zawirrować probówkę i niezwłocznie rozlać między trzy do pięciu żeli, używając 140 µL na szkiełko nakrywkowe, w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Szybko położyć silikonizowane szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm na wierzchu każdego żelu, zanim rozpocznie się polimeryzacja.

Nałożenie górnego szkiełka zakryjącego pozwoli akrylamidowi na całkowite pokrycie dolnego szkiełka zakrywającego. Inkubować tak przygotowaną kanapkę w temperaturze pokojowej do czasu spolimeryzowania akrylamidu; moment zakończenia polimeryzacji można określić, sprawdzając pozostałość roztworu akrylamidu w probówce do mikrocentryfugi.

Polimeryzacja zajmie kilka minut w przypadku żeli sztywnych i nieco więcej czasu w przypadku żeli miękkich. Po zakończeniu polimeryzacji ostrożnie podnieś kanapkę, używając sterylnych rękawiczek. Następnie przesuń górną szkiełko nakrywkowe, aż będzie wystawać poza spolimeryzowany żel.

Następnie podważ pokrywkę. Zsuń żel i wyrzuć górne szkiełko zakrywkowe. Umieść każde dolne szkiełko zakrywkowe z żelem, zwane w dalszej części hydrożelem, w płytce sześciodołkowej.

Następnie do każdego dołka płytki 6-dołkowej należy dodać 2 mL soli fizjologicznej fosforanowej (PBS). Potem hydrożele należy przemyć PBS i inkubować na potrząsaczkie przez 5 minut. Czynność przemywania należy powtórzyć dwukrotnie.

Aby rozpocząć eksperyment, należy pokryć każdy hydrożel dwiema mililitrami roztworu fibronektyny lub innego białka macierzy zewnątrzkomórkowej. Inkubować białko na hydrożelu przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić jego kowalencyjne związanie z hydrożelem; po nocnej inkubacji odessać roztwór ECM. Następnie zablokować nieaktywne grupy NHS, stosując 1 mg/mL aktywowanej termicznie albuminy surowicy bydlęcej wolnej od kwasów tłuszczowych w medium bezsurowiczym, i inkubować przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C.

Po inkubacji przemyj hydrożele raz sterylnym PBS. Następnie wysiej komórki w odpowiedniej pożywce hodowlanej zawierającej płodową surowicę bydlęcą. Bezpośrednio na hydrożel.

Wykorzystuje się ustabilizowane embrionalne fibroblasty mysie. Liczbę komórek wysiewanych na hydrożel należy określić na podstawie stopnia rozprzestrzeniania się komórek oraz konfluencji wymaganej do przeprowadzenia doświadczenia. Do analizy western blot oraz ilościwego PCR niezbędne są około 10⁵ komórek.

Następnie inkubuj komórki w warunkach odpowiednich dla danego typu komórek. Po zakończeniu okresu inkubacji wyizoluj białko komórkowe lub mRNA, w zależności od potrzeb.

Nanieś pipetą krople 100 µL buforu lizującego na arkusz paraformy na blacie laboratoryjnym, zachowując odstęp około dwóch do trzech centymetrów między poszczególnymi kroplami. Następnie ostrożnie wyjmij każdy hydrożel, podnosząc dolną szkiełko nakrywkowe z dołka. Używając zakrzywionej pęsety, umieść hydrożel stroną z komórkami skierowaną w dół na kroplach.

Inkubować komórki w buforze lizującym przez dokładnie jedną minutę. Następnie zdjąć szkiełka nakrywkowe i przenieść bufor lizujący do probówki do mikrowirówki. Alternatywnie, podczas ekstrakcji RNA przenieść każdy hydrożel do nowej płytki 6-dołkowej i dodać jeden mililitr triazolu do każdego dołka.

Inkubuj żele przez trzy minuty po zakończeniu inkubacji. Usuń roztwór triazolu i przechowuj go w probówce do mikrocentryfugi. Dokładne przemycie szkiełek podstawowych po dodaniu A-P-T-M-S jest kluczowym etapem w przygotowaniu reaktywnych szkiełek.

Właściwie umyte i wysuszone szkiełka nakrywkowe są wolne od jakichkolwiek pozostałości osadu. A-P-T-M-S zareaguje z glutaraldehydem, tworząc biały, mętny osad. W przypadku pojawienia się osadu całą procedurę należy powtórzyć, ponieważ szkiełko nakrywkowe nie nadaje się już do użytku.

Po sformowaniu hydrożelu i pokryciu go białkami ECM, komórki wysiewa się na noc. Istnieje wyraźna różnica w rozprzestrzenianiu się komórek na sztywnych i miękkich hydrożelach, co można zaobserwować w barwieniu phalloidiną; komórki fibroblastów embrionalnych myszy rozprzestrzeniają się w większym stopniu na hydrożelach sztywnych w porównaniu do miękkich. Rzeczywiście większość komórek przywierających do miękkiego hydrożelu pozostaje zwarta i przytwierdza się mniej efektywnie.

Reprezentatywne wyniki ilościowej PCR poziomu mRNA cykliny D1 w zarodkowych fibroblastach mysich wykazują, że ekspresja cykliny D1 jest znacząco podwyższona na sztywnej matrycy, ale nie na matrycy miękkiej. Sugeruje to, że sztywność matrycy reguluje progresję cyklu komórkowego in vitro. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób wytwarzania hydrożeli o różnej sztywności, co pozwala na modelowanie fizjologicznych warunków in vivo. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać o przygotowaniu dodatkowych reaktywnych szkiełek podstawkowych, ponieważ mogą wystąpić błędy lub wypadki.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.