Ocena immunologicznie istotnych dynamicznych cech struktury trzeciorzędowej sekwencji R2 korony pętli V3 HIV-1 za pomocą zwijania ab initio
15 września 2010
Region korony różnych sekwencji pętli V3 powierzchniowego glikoproteiny otoczki (gp120) HIV-1 może w wielu przypadkach zostać scharakteryzowany strukturalnie poprzez zwijanie in silico pozycji od 10 do 22 pętli przy użyciu nowoczesnego algorytmu zwijania ab initio. W niniejszej pracy prezentujemy zwijanie i ocenę tego regionu pętli V3 szczepu R2 HIV-1, który jest wyjątkowo wrażliwym na neutralizację szczepem o zagadkowych właściwościach funkcjonalnych.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena dynamicznych preferencji strukturalnych sekwencji peptydowej korony V3 szczepu R2 wirusa HIV za pomocą zwijania AR oraz skorelowanie wyników ze znaną wrażliwością szczepu R2 na neutralizację. Osiąga się to poprzez wybór odpowiedniego fragmentu korony pętli V3 szczepu R2 w celu wykonania zwijania AR bonni. W drugim kroku przeprowadzana jest symulacja zwijania, która przeszukuje wszystkie możliwe konformacje fragmentu korony R2 i zapisuje najbardziej prawdopodobne konformacje w pliku stosu.
Następnie przeanalizowano zapisane konformacje, aby określić dynamiczne preferencje strukturalne korony R2V3, które mogłyby wyjaśnić jej wrażliwość na neutralizację. Uzyskano wyniki wskazujące na preferencję dla sztywnej beta-nici w pozycjach 12–14 pętli V3, w oparciu o strukturę drugorzędową, preferencje oraz rozkład energii zestawu przeszukanych konformacji. Witam, jestem Timothy Cardozo, mówię do Państwa z mojego laboratorium w Departamencie Farmakologii w New York University School of Medicine.
Dzisiaj przedstawimy procedurę zwijania białka in vitro w obrębie elastycznej pętli immunogennego białka wirusowego HIV-1, znanego jako gp120. Elastyczna pętla ta jest znana jako pętla V3 powierzchniowej glikoproteiny otoczki wirusa HIV-1, a jej wierzchołek nazywany jest koroną pętli V3. Jest to region, który będziemy zwijać.
W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę, aby pomóc nam w identyfikacji produktywnych ścieżek prowadzących do projektowania skutecznych szczepionek przeciwko HIV. Zatem zacznijmy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wybrać sekwencję V3 crown do zwinięcia in silico.
Poprzednie badania przeprowadzone w tym laboratorium wskazują, że pozycje od 10 do 22 dowolnej sekwencji pętli V3 dają najlepsze wyniki; przeprowadź eksperymenty foldingowe armenio, korzystając z intuicyjnych menu rozwijanych w interfejsie graficznym (GUI) oprogramowania do modelowania molekularnego ICM Pro. Najpierw w wirtualnej przestrzeni komputera należy zbudować trójwymiarową strukturę atomową peptydu odpowiadającego tej sekwencji. Aby zbudować trójwymiarową strukturę atomową, przejdź do menu Plik i wybierz Nowy.
Wyświetli się ekran z kilkoma kartami. Wybierz kartę peptydów i wklej lub wpisz sekwencję w polu tekstowym. Kliknij OK, aby zbudować trójwymiarową strukturę peptydu.
Struktura pojawi się w oknie graficznym programu ICM. Po zbudowaniu struktury trójwymiarowej należy przejść do menu mechaniki molekularnej i wybrać opcję minimize, która otworzy menu boczne. Z menu bocznego należy wybrać opcję global.
Wyświetli się ekran z kilkoma polami wprowadzania danych oraz polami wyboru zaznaczonymi zgodnie z parametrami domyślnymi. W razie potrzeby zmień wybór, aby wskazać peptyd do sfałdowania. Dostosuj długość i precyzję symulacji, zmieniając odpowiednio liczbę ruchów globalnych (global moves) oraz liczbę wywołań lokalnego minimum (local min calls).
Wybierz opcję „all” dla zwijania wszystkich atomów peptydu. Następnie wybierz „save movie”, aby utworzyć plik filmowy z procesu zwijania. Na koniec kliknij „apply”, aby rozpocząć zwijanie w oknie graficznym.
Algorytm rozpoczyna zwijanie peptydu w różne konformacje, obliczając i zapisując energię peptydu dla każdej z nich. Po zakończeniu procesu zostanie zidentyfikowana i zwizualizowana na komputerze najbardziej stabilna energetycznie konformacja peptydu, a także konformacje alternatywne o niemal identycznej energii. Wykonywanie zwijania peptydu. Użycie interfejsu graficznego pokazuje, jak wygląda zwijanie, ale nie pozwala na optymalny dobór parametrów dla zwijania pętli V3.
W tym celu najlepiej wykonać zwijanie z niegraficznego wiersza poleceń przy użyciu skryptu. Skrypt to po prostu seria poleceń tekstowych zapisanych linijka po linijce w dokumencie lub pliku tekstowym, które są automatycznie wprowadzane do programu ICM i wykonywane jedna po drugiej w celu zwinięcia pętli V3. Najpierw należy utworzyć plik tekstowy i zapisać go na dysku twardym komputera w lokalnym katalogu. Podobnie jak wcześniej, należy zacząć od zbudowania peptydy w wirtualnej przestrzeni komputera.
Następnie nadaj nazwę symulacji i określ liczbę zmiennych swobodnych, którymi są wiązania chemiczne w peptydzie pozostawione w stanie swobodnej rotacji podczas zwijania. Dalej określ czas trwania symulacji niezbędny do optymalnego zwijania pętli V3. Wartość ta będzie zależeć od liczby zmiennych swobodnych zidentyfikowanych w poprzednim kroku; aby określić precyzję poszukiwania konformacyjnego w eksperymencie, ustaw liczbę kroków przeszukiwania, które mają zostać wykonane w każdym minimum lokalnym.
Następnie należy ustawić pozostałe parametry zoptymalizowane dla symulacji na podstawie wcześniejszych badań, w tym minimalizację temperatury, gradient oraz rozkład prawdopodobieństwa. Po ustawieniu parametrów eksperymentalnych należy wskazać, które obliczenia energii będą wykorzystywane podczas zwijania. W tym przypadku energia Vander Waalsa jest określona jako VW internal peptide.
Energia jest określana przez 14, energia wiązań wodorowych jest określana przez HB, energia elektrostatyczna przez El, energia solwatacji przez SF, a entropia przez EN. Określ ustawienia końcowe, w tym preferowane kąty szkieletu i łańcuchów bocznych do przeszukania oraz konformację początkową.
Na koniec należy wpisać polecenie uruchomienia i zapisania obliczeń. Po napisaniu skryptu i zapisaniu go jako plik tekstowy, należy go uruchomić z wiersza poleceń systemu operacyjnego komputera. Podobnie jak poprzednio, zostanie zidentyfikowana i zapisana w pliku projektu najstabilniejsza energetycznie konformacja peptydu, a także konformacje alternatywne o porównywalnej energii, w celu ich późniejszej wizualizacji na komputerze.
Po zakończeniu obliczeń otwórz plik, wybierając opcję file open z rozwijanego menu EE. Wyświetl cząsteczkę, zaznaczając pole wyboru obok niej w panelu obszaru roboczego, a następnie wybierz widok molecular mechanics stack view. Aby wyświetlić uporządkowany według energii stos najlepszych konformacji peptydów z procesu zwijania, kliknij narzędzie wykresowania w prawym dolnym rogu panelu stosu, aby przedstawić wyniki.
Najpierw kliknij OK w wyświetlonym oknie, a następnie wybierz środkową zakładkę wykresu o nazwie best confo. Następnie kliknij pierwszy wiersz tabeli wyników, który odpowiada konformacji o najniższej energii znalezionej podczas wyszukiwania. Struktura peptydu zostanie przekształcona w jej konformację o najniższej energii w oknie graficznym.
Przeanalizuj tę konformację pod kątem cech charakterystycznych dla pasm beta lub helis alfa, szczególnie w obrębie pierwszych pięciu pozycji peptydowych. Wybierz ten region w sekwencji, a następnie kliknij ikonę pręta w lewym górnym rogu ekranu, aby wyświetlić wszystkie atomy. Następnie należy przeanalizować zestaw wyników energetycznych, aby wykreślić najlepsze konformacje.
Jeśli konformacja o najniższej energii jest oddzielona znaczną luką od pozostałych konformacji, wskazuje to na tendencję do tworzenia sztywnej struktury. Aby ocenić wyniki, otwórz fiolkę projektu i wybierz widok stosu mechaniki molekularnej (molecular mechanics stack view), co spowoduje wyświetlenie tabeli konformacji w stosie. Zwizualizuj konformacje stosu, klikając ikonę histogramu wykresu.
Na koniec kliknij przycisk odtwarzania stosu mechaniki molekularnej, aby utworzyć animację stosu i zwizualizować preferencje konformacyjne ujawnione podczas zwijania. Przedstawiono wyniki dla zwijania R two. Konformacja nie jest helisą alfa i stanowi przypadkową kłębkową strukturę, co jest oczekiwane dla koron pętli V three, zwłaszcza w fragmencie od reszty 12 do 14.
W pętli V3 widoczna jest wyraźna preferencja konformacyjna dla pasm beta w całym stosie, natomiast zaobserwowano bardzo mało konformacji helikalnych alfa. Lokalna konformacja pasma beta rozpoznawana jest po rozciągniętym, liniowym kształcie. W tym miejscu znajduje się nietypowa sekwencja izoleucyna-prolina-metionina szczepu R2, która jest rzadka w szczepach HIV w tej pozycji i której przypisuje się odpowiedzialność za niezwykłe cechy R2.
Ponadto, między konformacją o najniższej energii a konformacją o drugiej najniższej energii widoczna jest przerwa energetyczna wynosząca prawie trzy jednostki. Zatem struktura przyjmuje konformację o najniższej energii przez ponad 99% czasu, co sugeruje, że korona R two V three oraz jej lokalna konformacja beta strain w pozycjach od 12 do 14 mają strukturę bardziej sztywną, a nie całkowicie elastyczną. Przedstawiliśmy właśnie sposób fałdowania sekwencji korony pętli V three przy użyciu algorytmu abio zaimplementowanego w oprogramowaniu ICM oraz sposób analizy wyników na przykładzie szczepu R two wirusa HIV.
Przykładowo, podczas wykonywania tej procedury ważne jest uważne dobranie tożsamości peptydu fałdującego odpowiadającego fragmentowi korony V3, a także właściwa interpretacja wyników w odniesieniu do preferencji konformacyjnej i energii, w oparciu o konsultacje z ekspertem w dziedzinie modelowania molekularnego. To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie ocenia dynamiczne preferencje strukturalne sekwencji peptydu korony V3 szczepu R2 HIV-1 z wykorzystaniem zaawansowanych symulacji zwijania. Wyniki mają na celu powiązanie tych preferencji strukturalnych z wrażliwością szczepu na neutralizację.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia strukturalna
- Wirusologia
- Biologia obliczeniowa
Wstęp
- Pętla V3 białka gp120 HIV-1 ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia jego neutralizacji.
- Szczep R2 HIV-1 wykazuje unikalną wrażliwość na neutralizację.
- Techniki zwijania in silico mogą dostarczyć wiedzy na temat dynamiki strukturalnej białek wirusowych.
- Zrozumienie tej dynamiki może pomóc w projektowaniu szczepionek i strategii terapeutycznych.
Cel badania
- Ocena preferencji strukturalnych sekwencji peptydowej korony V3.
- Korelacja wyników zwijania z wrażliwością na neutralizację szczepu R2.
- Identyfikacja kluczowych cech strukturalnych wpływających na zachowanie wirusa.
Zastosowane metody
- Wybór fragmentu korony pętli R2 V3 do symulacji zwijania.
- Wykorzystanie algorytmu zwijania ab initio do analizy strukturalnej.
- Symulacja zwijania w celu zbadania możliwych konformacji.
- Analiza zapisanych konformacji w celu określenia dynamicznych preferencji strukturalnych.
Główne wyniki
- Wyniki wskazują na preferencję sztywnej konformacji pasma beta w pozycjach od 12 do 14.
- Na podstawie rozkładu energii zaobserwowano preferencje struktury drugorzędowej.
- Otrzymane wyniki mogą wyjaśniać wrażliwość szczepu R2 na neutralizację.
- Dane wspierają hipotezę, że dynamika strukturalna wpływa na neutralizację wirusa.
Wnioski
- Badanie dostarcza informacji na temat charakterystyki strukturalnej pętli V3 szczepu R2.
- Zrozumienie tej dynamiki jest kluczowe dla opracowania skutecznych metod interwencji przeciwko HIV-1.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu ulepszenia strategii terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie dynamicznych preferencji strukturalnych korony pętli V3 wirusa HIV-1 jest kluczowe dla minimalizacji ryzyka w przypadku kandydatów na szczepionki poprzez powiązanie sztywności konformacyjnej z wrażliwością na neutralizację. To podejście obliczeniowe umożliwia szybką analizę strukturalną różnych szczepów wirusa, wspierając walidację celów oraz mechanistyczną ocenę ryzyka we wczesnej fazie odkrywania. Poprzez korelację wyników zwijania z aktywnością immunologiczną, metoda ta pozwala na określenie pewności predykcyjnej w projektowaniu antygenów i priorytetyzację portfolio w procesie opracowywania szczepionek przeciwko HIV.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez powiązanie sekwencji pętli V3 z dynamiką strukturalną i rozpoznawaniem immunologicznym.
- Wartość operacyjna: Umożliwia szybkie przesiewanie in silico tysięcy krążących szczepów HIV-1 bez ograniczeń eksperymentalnych.
- Wartość naukowa: Wspiera biologiczne ograniczanie ryzyka poprzez identyfikację konserwowanych motywów strukturalnych w obrębie zmienności sekwencji.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane modele strukturalne do późniejszego mapowania epitopów i testów wiązania przeciwciał.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje analizę konformacyjną poprzez powtarzalne protokoły zwijania ab initio.
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe wyniki energii i struktury drugorzędowej do porównawczej oceny szczepów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy spostrzeżenia strukturalne z etapu odkrywania z przedkliniczną oceną wywoływania przeciwciał szeroko neutralizujących.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od modelowania obliczeniowego do badań immunogenności w odpowiednich modelach chorobowych.
- Wartość naukowa: Wspiera postępy skorygowane o ryzyko poprzez identyfikację cech strukturalnych związanych z wrażliwością na neutralizację.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od identyfikacji celu po optymalizację związku wiodącego, umożliwiając redukcję ryzyka strukturalnego przed zaprojektowaniem immunogenu.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez dotyczących zależności między sekwencją, strukturą a funkcją w białkach otoczki wirusowej.
- Przesiewanie: Dostarczanie gotowych do analizy zespołów strukturalnych z określonymi preferencjami konformacyjnymi.
- Analityka: Zapewnienie uszeregowanych według energii stosów konformacyjnych oraz preferencji struktury drugorzędowej w celu obiektywnego porównania.
- Badania translacyjne: Powiązanie dynamiki strukturalnej z fenotypami neutralizacji obserwowanymi w modelach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanowienie wielokrotnego użytku obliczeniowego przepływu pracy do oceny elastyczności antygenowej różnych celów wirusowych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w regionach elastycznych pętli.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność analizy strukturalnej dla różnorodnych sekwencji wirusowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go w wyborze antygenu poprzez wyjaśnienie strukturalnych determinantów podatności immunologicznej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na szczepionki z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o korelaty strukturalne i immunologiczne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu obliczeniowej biologii strukturalnej oraz oprogramowania do modelowania molekularnego.
- Zależne od dostępu do algorytmów zwijania białek ab initio oraz wystarczających zasobów obliczeniowych do próbkowania konformacyjnego.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej pomiędzy grupami zajmującymi się modelowaniem, immunologią i projektowaniem szczepionek.
- Uwzględnia kwestie adaptacyjne przy stosowaniu protokołu do różnych systemów pętli wirusowych lub białkowych celów.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak dokładność pola siłowego oraz kompletność próbkowania w obszarach o wysokiej elastyczności.
Często zadawane pytania (FAQ) dot. biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Title
1:07
Introduction
4:19
R2 HIV-1 Strain V3 Loop ab initio Folding via the ICM-Pro Command Line
1:57
R2 HIV-1 Strain V3 Loop ab initio Folding via the ICM-Pro GUI
6:35
ab initio Folding Data Analysis
8:41
Representative Results for R2 HIV-1 Strain V3 Loop ab initio Folding
9:59
Conclusion
