Wyznaczanie struktur molekularnych glikoprotein otoczki HIV z wykorzystaniem krioelektronowej tomografii i zautomatyzowanego uśredniania subtomogramów

Ponad 60 milionów osób zostało zakażonych wirusem HIV, który wywołuje AIDS. HIV/AIDS stanowi globalny kryzys zdrowotny i choć intensywne wysiłki badawcze drastycznie wydłużyły życie osób zakażonych, opracowanie skutecznej szczepionki wciąż pozostaje nieosiągalne. Głównym punktem badań nad szczepionką przeciwko HIV jest glikoproteina otoczki, której wirus HIV używa do wnikania do komórek docelowych.

W tym filmie demonstrujemy, w jaki sposób uzyskujemy struktury tego ważnego białka, wykorzystując technikę obrazowania zwaną kriotomografią elektronową. Zaczynając od oczyszczonego HIV, przedstawiamy kolejne etapy przygotowania mrożonych próbek, proces rejestracji obrazów z mikroskopu elektronowego tych mrożonych próbek oraz kroki konwersji tych obrazów w modele strukturalne, które mogą być przydatne przy projektowaniu szczepionek przeciwko HIV/AIDS. Unikalnym aspektem prezentowanej treści jest fakt, że prace zostaną zademonstrowane przez członków jej laboratorium w szerokim zakresie wieku: od uczniów szkół podstawowych i średnich, poprzez studentów studiów licencjackich i magisterskich, aż po stażystów podoktorskich oraz starszych naukowców.

Przygotowanie witryfikowanych próbek wirusów odpowiednich do krio-tomografii elektronowej polega na rozprowadzeniu wodnej zawiesiny wirusów w małych otworach w błonie węglowej osadzonej na miedzianej siateczce, a następnie szybkim zamrożeniu wirusów. Celem tego etapu jest przygotowanie zamrożonego preparatu nienaruszonych wirusów utrwalonych w stanie zbliżonym do naturalnego. W pierwszej kolejności siateczki umieszcza się w urządzeniu do wyładowań koronowych.

Urządzenie to oczyszcza siatki poprzez poddanie ich działaniu zjonizowanego gazu. Po przygotowaniu siatek do użycia przygotowuje się zawiesinę wirusów zmieszaną z małymi cząsteczkami złota. Cząsteczki te są niezbędne do gromadzenia i przetwarzania danych.

Następnie na świeżo oczyszczoną plazmą siatkę nanosi się kroplę zawiesiny wirusów. Siatka zostaje następnie umieszczona w robocie, który osusza ją za pomocą papieru filtracyjnego, redukując kroplę do cienkiego filmu cieczy. Próbka zostaje następnie zanurzona w ciekłym etanie, co powoduje gwałtowne zamrożenie wirusów z szybkością przekraczającą 100 000 kelvinów na sekundę.

Siatkę zamrożoną metodą plunge-freezing przenosi się następnie do pudełka do przechowywania w celu transportu do mikroskopu. Czynność tę powtarza się do momentu zamrożenia pożądanej liczby siatek. Po przygotowaniu siatek z próbkami wirusa kolejnym krokiem jest ich załadowanie do mikroskopu.

W przypadku obrazowania proces ten może być wykonywany ręcznie lub z pomocą robota. Podczas ręcznego ładowania siatek z próbkami użytkownik znajduje się przy specjalistycznym stanowisku, gdzie próbki mogą być manipulowane w ciekłym azocie; następnie próbki umieszcza się w przenośnej komorze chłodzonej azotem, która zostaje zamknięta, odpompowana, a następnie przyłączona do mikroskopu. Nowsze mikroskopy umożliwiają bardziej zautomatyzowane ładowanie próbek.

W mikroskopie Titan Cryos zamrożone próbki są dostarczane przez użytkownika, a następnie robotycznie przenoszone na siatki obiektowe załadowane w mikroskopie. Przed rozpoczęciem obrazowania użytkownik może zbadać każdą siatkę. Parametry mikroskopu są ustawiane dla każdego obszaru na siatce próbki, który zawiera interesujące cechy.

W tym przypadku cechami są wirusy HIV. W miarę definiowania każdego nowego obszaru, komputer mikroskopu zapisuje parametry obrazowania specyficzne dla tego obszaru. Gdy użytkownik zdefiniuje wszystkie interesujące go pozycje, komputer automatycznie powraca do każdej z nich i gromadzi zestaw danych.

Każdy zestaw danych jest zbierany poprzez pochylanie siatki z próbką względem wiązki elektronów, przy jednoczesnym zapewnieniu, że wiązka pozostaje skupiona w tym samym punkcie siatki. Pozyskiwanie danych w mikroskopii elektronowej tradycyjnie wymagało od użytkowników siedzenia przy mikroskopie i fizycznej interakcji z urządzeniem. Taki sposób obsługi mikroskopu pokazano tutaj podczas wizyty prezydenta Obamy w fabryce Intel.

Ostatnie postępy w interfejsach komputerowych mikroskopów pozwalają obecnie użytkownikom na monitorowanie i korygowanie procesu gromadzenia danych w czasie rzeczywistym z poziomu zdalnego komputera w laboratorium lub w innym miejscu. Aby zwizualizować kształty otoczki oraz kolców glikoproteinowych, informacje z setek pojedynczych obrazów muszą zostać uśrednione w celu wzmocnienia sygnału. Jest to proces wymagający dużej mocy obliczeniowej, który w niniejszym przypadku jest realizowany przy użyciu klastra komputerowego o nazwie Bio Wolf.

W NIH opracowano potężne metody pozwalające na wyodrębnianie poszczególnych wolumenów i uśrednianie informacji przy użyciu algorytmów zdolnych do pracy przy wysokim poziomie szumu. Mapy gęstości uzyskane zarówno z natywnych wirusów, jak i wirusów w kompleksach z biologicznie istotnymi cząsteczkami, które są nieodłącznym elementem tego rodzaju danych, stanowią bogatą bazę informacji na temat biologii strukturalnej HIV. Mapy gęstości zyskują szczegółowość na poziomie molekularnym, gdy dane te zostaną połączone z informacjami z krystalografii rentgenowskiej poszczególnych podjednostek tworzących kolca glikoproteiny otoczki.

Dane pochodzące z tych tomogramów mogą być bardzo gęste i trudne do interpretacji. Oprogramowanie 3D przeznaczone dla przemysłu rozrywkowego może być wykorzystane do wizualizacji modeli 3D poprzez dodawanie kolorów, tekstur i oświetlenia, co ułatwia ich analizę. Powszechnie stosowane oprogramowanie do wizualizacji obejmuje Mirror 3D Studio Max oraz Maya.

Przedstawiliśmy właśnie szczegółowe procedury uzyskiwania modeli molekularnych struktury glikoproteiny otoczki, zaczynając od oczyszczonego HIV. Wykorzystując tę metodę, określiliśmy również struktury glikoproteiny otoczki w kompleksach z różnymi cząsteczkami, które mogą wiązać się z wirusem i oddziaływać na niego.

W niniejszym materiale przedstawiamy przykład struktury glikoproteiny otoczki w kompleksie z przeciwciałem o nazwie B12. Zrozumienie, dlaczego niektóre cząsteczki mogą wiązać i neutralizować wirusa, podczas gdy inne tego nie robią, jest niezwykle istotne dla racjonalnego projektowania szczepionek. Wyznaczanie struktur molekularnych glikoprotein otoczek HIV lub innych wirusów, takich jak grypa i Ebola, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów wnikania i neutralizacji wirusów.

Jak Państwo widzieli, kriotomografia elektronowa wyłania się obecnie jako potężne narzędzie pozwalające na osiągnięcie tego celu.