Test fluorescencyjny oparty na gramicydynie; do oznaczania potencjału małych cząsteczek w modyfikowaniu właściwości dwuwarstwy lipidowej

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar zmian właściwości dwuwarstwy indukowanych przez lek, wykrywalnych za pomocą białek przebiegających przez dwuwarstwę. Jest to realizowane poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności dużych jednokierunkowych pęcherzyków (sles) załadowanych fluoroforem. Drugim krokiem procedury jest domieszkowanie pęcherzyków graminą.

Trzecim krokiem procedury jest dodanie zewnętrznego wygaszacza i pomiar szybkości wygaszania wewnętrznego fluoroforu. Czwartym i ostatnim krokiem procedury jest ilościowe określenie zmiany wygaszania fluorescencji w zależności od aktywności gramin poprzez dopasowanie funkcji wykładniczej rozciągniętej do przebiegu fluorescencji w czasie. Ostatecznie można uzyskać wyniki pozwalające ocenić, czy amfifile mogą zmieniać właściwości dwuwarstwy lipidowej.

Witajcie, jestem Ola Anderson. Witajcie, jestem Helson. Cześć, jestem Richie Kapo.

Nazywam się Leah Sanford i pochodzę z laboratorium dr. Olafa Andersona z Katedry Fizjologii i Biofizyki w Weill Cornell Medical College. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu procedurę pomiaru zmian właściwości lipidowej dwuwarstwy. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania wpływu leków i małych cząsteczek na właściwości lipidowej dwuwarstwy.

Zacznijmy. Pierwszego dnia procedury wyjmij lipid z zamrażarki i poczekaj, aż osiągnie temperaturę pokojową. Po wyrównaniu temperatury dodaj 0,6 ml roztworu lipidów w chloroformie o stężeniu 25 mg/ml do kolby okrągłorzypowej o pojemności 25 ml. Następnie odparuj roztwór w strumieniu azotu, cały czas obracając kolbę, aż do całkowitego odparowania chloroformu.

Kiedy cienka biała warstwa lipidów pokryje całą dolną połowę kolby, dodatkowo wysuszaj lipidy w deskrykatorze pod próżnią przez noc. Przygotuj roztwór 100 mM azotanu sodu, 25 mM ANTS oraz 10 mM HEPES o pH 7. Podczas regulowania pH tego roztworu unikaj stosowania wszelkich roztworów zawierających chlorki.

Ponieważ gasiciel talowy tworzy nierozpuszczalny kompleks z chlorkiem w drugim dniu, nawodnij lipidy w 1,67 ml tego roztworu elektrolitu, aby uzyskać 10 mM zawiesinę lipidową. Po osiągnięciu odpowiedniego stężenia przykryj naczynie folią Parafilm, dokładnie wymieszaj zawiesinę w wortexie, zabezpiecz próbkę przed światłem folią aluminiową i pozostaw do dojrzewania w temperaturze pokojowej przez noc.

W trzecim dniu poddaj mieszaninę działaniu sonikatora o niskiej mocy przez jedną minutę. Następnie wykonaj cykle zamrażania i rozmrażania próbki, umieszczając ją na pięć minut na suchym lodzie, a następnie na pięć minut w ciepłej wodzie; powtórz ten cykl cztery do pięciu razy. Przeciśnij zawiesinę lipidową za pomocą mini-ekstrudera Avanti.

Przygotuj mini-ekstruder z polikarbonatowym filtrem o porach 0,1 mikrona oraz wspornikami filtra; przepuść zawiesinę przez filtr w obie strony 21 razy, aż w przeciwległej strzykawce znajdzie się niemal przezroczysta zawiesina, co pozwoli uzyskać zawiesinę dużych jednorodnych pęcherzyków (LUV). Usuń zewnętrzny A NTS, przepuszczając ekstrudowaną zawiesinę przez kolumnę desalcyjną PD 10, która została uprzednio równoważona buforem sodowym. Nałóż na kolumnę 1,5 mililitra zawiesiny LUV oraz jeden mililitr buforu sodowego.

Po całkowitym wprowadzeniu roztworu do kolumny, wymyj liposomy trzema mililitrami buforu sodowego i zbierz eluat. Powstały roztwór zapasowy LUV wypełnionych A NTS powinien zawierać około czterech do pięciu milimoli lipidu i być półprzezroczysty, mlecznobiały.

Chronić roztwór przed światłem za pomocą folii i przechowywać w temperaturze 13 °C; na 24 godziny przed użyciem dokładnie wymieszać w wstrząsarce typu vortex. Roztwór zapasowy LUV wypełniony A NTS. Ponieważ UUV mają gęstość większą niż 1 g/ml, mogą osiadać na dnie.

Następnie rozcień roztwór stokowy LUV wypełnionych A NTS w stosunku 1:20 w buforze sodowym. Trzy czwarte liposomów inkubuj z 260 ng abidyny w DMSO. Do pozostałej jednej czwartej dodaj taką samą objętość DMSO bez graminy.

Aby utrzymać stałe stężenie rozpuszczalnika we wszystkich próbkach, należy pozostawić graminy do stanu równowagi między wewnętrzną a zewnętrzną warstwą lipidowych pęcherzyków przez 24 godziny w temperaturze 13 °C. W tym celu do pomiaru szybkości gaszenia fluorescencji zastosowano spektrofluorymetr z systemem stop-flow Applied Photophysics SX point 20 z kontrolą temperatury. Przed rozpoczęciem pomiarów należy włączyć urządzenia na godzinę wcześniej, aby umożliwić ich rozgrzanie.

Szczelina z raportami dla wzbudzenia powinna być ustawiona na jeden na jeden, a do rejestracji emisji przy użyciu oprogramowania pro data SX należy zastosować filtr górnoprzepustowy 455 nanometrów. Najpierw skonfiguruj warunki rejestracji, ustawiając długość fali wzbudzenia monochromatora na 352 nanometry. Użyj ustawienia podtrzymania ciśnienia.

Ustaw czas na jedną sekundę, a liczbę punktów na 5 000. Dostosuj liczbę powtórzeń do dziewięciu dla pomiarów buforu oraz do 13 dla pomiarów z wygaszaczem. Monitoruj temperaturę w profilu sprawdzania napędu w oprogramowaniu Essex.

Objętość tłoczenia powinna zostać ustawiona na 120 µL, co pozwala na zmieszanie 60 µL z każdej strzykawki. Zapewnia to czas martwy wynoszący około 1,2 ms. Napięcie wysokiego napięcia lub wzmocnienie detektora fluorescencji należy ustawić na około 420 V.

Celem jest uzyskanie odczytu fluorescencji na poziomie około ośmiu; inkubować wcześniej przygotowane UUV obciążone A NTS przez 10 minut w temperaturze 25 °C w ciemności. Po wyrównaniu temperatury wymieszać próbkę w wirówce vorex, a następnie wprowadzić ją do lewej strzykawki. Do prawej strzykawki wprowadzić bufor sodowy lub thallium.Quencher.

Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, przesuwając tłoki strzykawek w przód i w tył. Obie strzykawki powinny być wypełnione w takim samym stopniu. Przed zamknięciem zaworów dla pierwszej próbki zmierz fluorescencję w buforze sodowym.

Powtórzyć czynność cztery razy, dostosowując wzmocnienie w razie potrzeby. Następnie powtórzyć procedurę dodatkowe pięć razy dla pozostałych próbek. Zarejestrować dziewięć powtórzeń z buforem sodowym.

Zastąp bufor sodowy wygaszaczem talowym i zarejestruj 13 powtórzeń. Przepłucz wodą i kontynuuj z kontrolami kolejnych próbek. Uwzględnij próbki bez graminy i z rozpuszczalnikiem, a także bez graminy i z maksymalnym stężeniem związku.

Po przeprowadzeniu analizy fluorescencyjnej zarówno dla graminy, jak i rozpuszczalnika, należy wprowadzić dane do oprogramowania MATLAB w celu ich analizy. Dla każdej próbki odczytano wszystkie powtórzenia dla buforu i wygaszacza; pierwsze cztery powtórzenia będą zanieczyszczone substancją, która znajdowała się wcześniej w przewodach. W tym przypadku sygnał pochodzi z mieszania się próbki buforu sodowego z wodą z poprzedniego płukania.

Powtórzenia od piątego do dziewiątego reprezentują sygnał pochodzący wyłącznie z próbki. W związku z tym w każdym przypadku zawsze wykluczamy cztery pierwsze powtórzenia. Aby uniknąć artefaktów związanych z mieszaniem, należy ręcznie przejrzeć ślady i usunąć wszelkie błędne powtórzenia, takie jak czerwony ślad zawierający piki lub odchylenia wynikające z artefaktów mieszania i/lub pęcherzyków powietrza.

Następnie znormalizuj powtórzenia dla wygaszacza względem średniej wartości początkowej powtórzeń buforu dla każdej próbki w każdym warunku eksperymentalnym, a średnie ze wszystkich próbek połącz w jeden wykres; próbki wizualizacyjne bez gramicydyny powinny być do siebie podobne i nie wykazywać niemal żadnego wygaszania fluorescencji. W próbkach z gramicydyną obserwuje się powolny spadek sygnału fluorescencji wynikający z powolnego przenikania jonów talu do pęcherzyków. Jeśli przebieg czasowy fluorescencji uległ widocznej zmianie pod wpływem związku, oznacza to, że związek ten zmienia właściwości dwuwarstwy lipidowej w przetestowanym stężeniu; następnie dopasuj funkcję wykładniczą rozciągniętą do pierwszych 2–100 ms znormalizowanych krzywych wygaszania fluorescencji.

Wykonaj powtórzenia dla poszczególnych prób i oblicz szybkość w drugiej milisekundzie. Następnie, na podstawie poszczególnych powtórzeń, oblicz średnie i odchylenia standardowe dla danej próbki. Wpływ kapsaicyny, oznaczonej tutaj jako cap, zaobserwowano w przebiegu czasowym gaszenia fluorescencji w obecności lub w nieobecności graminy, oznaczonej jako ga; znormalizowany sygnał fluorescencji przedstawiono tutaj w skali jednej sekundy. Szare kropki reprezentują wyniki ze wszystkich powtórzeń, natomiast czerwone linie są wartościami średnimi.

Przedstawiono pierwsze 100 milisekund znormalizowanego sygnału fluorescencyjnego. Szare kropki to wyniki z pojedynczego powtórzenia dla każdego warunku. Czerwone linie to dopasowania wykładnicze rozciągnięte do tych powtórzeń.

Przerywana niebieska linia oznacza markę dwóch milisekund. Jest to czas, w którym wyznacza się szybkość wygaszania. Względną zmianę szybkości wygaszania określa się poprzez normalizację danych względem próbki kontrolnej z graminą i bez modyfikatora.

Kiedy kapsaicyna adsorbuje się do lipidowej dwuwarstwy, zmienia ona właściwości tej dwuwarstwy. Zmiana w kierunku bardziej plastycznej dwuwarstwy objawi się jako przesunięcie w stronę gramu w równowadze mono-dimer na korzyść przewodzącego dimeru. Przedstawiliśmy właśnie procedurę pomiaru efektów zaburzających dwuwarstwę przez małą cząsteczkę.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zastosowaniu odpowiednich kontroli dla każdego eksperymentu, wykorzystując tę samą partię pęcherzyków. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.