Fluorescencyjny test przesiewowy do identyfikacji modulatorów kanałów GIRK
24 kwietnia 2012
Opisano procedurę przesiewową w czasie rzeczywistym służącą do identyfikacji leków oddziałujących z kanałami K+ wewnątrzstymulowanymi, bramkowanymi przez białka G (GIRK). Test wykorzystuje fluorescencyjne barwniki czułe na potencjał błonowy do pomiaru aktywności kanałów GIRK. Technika ta może być dostosowana do zastosowania w wielu liniach komórkowych.
Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie nowych leków modulujących kanały grk. Jest to realizowane poprzez najpierw wysianie komórek A TT 20 na płytkę 96-dołkową. Drugim krokiem jest rozcieńczenie badanych związków przy użyciu systemu obsługi płytek płynnych Verset.
Następnie, za pomocą dozownika, nanosi się rozcieńczone związki testowe na komórki. Ostatnim krokiem jest umieszczenie płytki 96-dołkowej w fluorescencyjnym czytniku płytek Synergy two oraz wstrzyknięcie do dołków roztworów kontrolnych i somatostatyny. W końcowym etapie czytnik fluorescencyjny służy do wykazania związków, które zmieniają indukowany somatostatyną sygnał fluorescencyjny, a tym samym modulują kanały Grk.
Przewagą tej procedury nad istniejącymi metodami, takimi jak rejestracja metodą patch-clamp, jest możliwość szybkiego przesiewu dużej liczby związków w celu ustalenia, czy modulują one kanały Gerk. Znaczenie tej techniki rozciąga się na leczenie bólu, ponieważ pozwala ona na identyfikację związków aktywujących kanał Gerk, co prowadzi do zahamowania nocyceptywnej transmisji FI. Procedurę powlekania płytek 96-dołkowych oraz wysiewania komórek demonstruje Maribel Vasquez.
Student w moim laboratorium rozpoczął tę procedurę od hodowli komórek przysadki A TT 20 w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% surowicy konia w temperaturze 37 °C w atmosferze z dodatkiem 5% CO2. Kulturę utrzymywano poprzez pasażowanie komórek co pięć do siedmiu dni zgodnie ze standardową procedurą. Następnie pokryto dno dołków czarnej przezroczystej płytki.
Dno płytki 96-dołkowej pokryć 50 µL poli-L-lizyny. Pozostawić do wyschnięcia dołków przez 30 minut w inkubatorze. Następnie usunąć nadmiar poli-L-lizyny i wysiać komórki do płytki 96-dołkowej zawierającej 200 µL medium w gęstości 30 000 komórek na dołek.
Następnie inkubować komórki przez trzy do czterech dni. Za pomocą zestawu do aspiracji powoli odessać pożywkę hodowlaną z monowarstwy komórek, a następnie przemyć komórki 200 µL zwykłego roztworu buforowego. Następnie do każdej z nich dodać 200 µL roztworu buforowego zawierającego barwnik wrażliwy na potencjał błonowy.
Inkubuj komórki przez 40 minut w temperaturze 37°C. Po 40 minutach wyjmij komórki A TT 20 z inkubatora, odstaw je do osiągnięcia temperatury pokojowej i odessaj stary bufor. Następnie nanieś na komórki świeży roztwór buforowy zawierający MPD.
Następnie, przy użyciu systemu do obsługi cieczy, nanieś na komórki różne stężenia związków testowych i roztworów kontrolnych. Komórki na płytce 96-dołkowej inkubuj przez pięć minut ze związkami testowymi przed wykonaniem pomiarów fluorescencji. W tej procedurze umieść płytkę 96-dołkową w czytniku płytek fluorescencyjnych Biotech Synergy Two.
Wyznacz sygnał tła fluorescencji przy długości fali wzbudzenia 520 nanometrów i długości fali emisji 560 nanometrów. Następnie, za pomocą systemu injektora Synergy two, dodaj do dołków ligandy G PCR R lub roztwór kontrolny, aby aktywować kanały GIR. Następnie zbierz punkty danych w odstępach dziesięciosekundowych przez 302-sekundowy okres próbkowania.
Przy długościach fal wzbudzenia i emisji. Oblicz współczynnik Z, aby określić wiarygodność testu. Współczynniki Z w zakresie od 0,5 do 1,0 wskazują na doskonałą jakość testu.
Płytki z czynnikami Z poniżej 0,5 są wykluczane. Z analizy wyodrębniono związki modulujące sygnał fluorescencyjny, które poddano ponownym testom w obecności 2 mM chlorku baru lub 500 nM terapiny Q, aby potwierdzić specyficzność wobec wewnątrzsterownych kanałów potasowych; przedstawiono tutaj reprezentatywny sygnał fluorescencyjny HLB 0 2 1 1 15 2 mierzony w czasie w komórkach A TT 20 po dodaniu somatostatyny lub roztworu kontrolnego. Stosunek intensywności fluorescencji na osi Y obliczono poprzez podzielenie sygnału w obecności somatostatyny lub roztworu kontrolnego przez sygnał bazowy zmierzony przed dodaniem somatostatyny lub roztworu kontrolnego.
Przedstawiono tutaj traktowanie komórek A TT 20 stężeniem 500 nM Terapin Q, który hamuje indukowany somatostatyną spadek sygnału fluorescencyjnego poprzez wiązanie i blokowanie kanałów G. Przedstawiono również traktowanie komórek A TT 20 stężeniem 20 µM propafenonu, który także hamuje indukowany somatostatyną spadek sygnału fluorescencyjnego. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje dwie godziny.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu identyfikacji leków modulujących kanały grk z wykorzystaniem fluorescencyjnego czytnika płytek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje procedurę przesiewową w czasie rzeczywistym służącą do identyfikacji leków oddziałujących z kanałami potasowymi wewnątrz rectifierami bramkowanymi białkami G (GIRK). Metoda ta wykorzystuje fluorescencyjne barwniki wrażliwe na potencjał błonowy do pomiaru aktywności kanałów GIRK, co czyni ją możliwą do zastosowania w przypadku różnych linii komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Farmakologia
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
Wstęp
- Kanały GIRK odgrywają kluczową rolę w przekaźnictwie neuronalnym.
- Identyfikacja modulatorów kanałów GIRK może prowadzić do opracowania nowych strategii terapeutycznych.
- Analizy w czasie rzeczywistym zwiększają efektywność przesiewania leków.
- Barwniki fluorescencyjne zapewniają czuły pomiar aktywności kanałów.
Cel badania
- Opracowanie procedury przesiewowej w celu wykrycia leków modulujących kanały GIRK.
- Wykorzystanie formatu wysokoprzepustowego do testowania wielu związków.
- Pogłębienie wiedzy na temat farmakologii kanałów GIRK.
Zastosowane metody
- Wysiewanie komórek TT 20 na płytkę 96-dołkową.
- Wykorzystanie systemu do obsługi cieczy Verset do rozcieńczania związków testowych.
- Aplikowanie rozcieńczonych związków do komórek za pomocą systemu Verset.
- Wykorzystanie fluorescencyjnego czytnika płytek Synergy two do pomiaru odpowiedzi.
Główne wyniki
- Identyfikacja związków modyfikujących sygnały indukowane przez somatostatynę.
- Wykazanie możliwości adaptacji testu do różnych linii komórkowych.
- Skuteczna modulacja aktywności kanałów GIRK przez badane związki.
- Walidacja skuteczności fluorescencyjnego czytnika płytek w procesie przesiewowym.
Wnioski
- Opracowany test jest wartościowym narzędziem w procesie poszukiwania leków celujących w kanały GIRK.
- Przesiewy w czasie rzeczywistym mogą przyspieszyć identyfikację potencjalnych środków terapeutycznych.
- Konieczne są dalsze badania w celu sprawdzenia implikacji klinicznych zidentyfikowanych związków.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy test umożliwia wysokoprzepustową identyfikację modulatorów kanałów GIRK, wspierając walidację celów w badaniach nad neurobiologią oraz w procesie odkrywania leków kardyvaskularnych. Dzięki zapewnieniu ilościowych odczytów fluorescencji w czasie rzeczywistym, metoda ta zmniejsza zależność od niskoprzepustowej elektrofizjologii i przyspiesza przejście z etapu identyfikacji hitów do optymalizacji wiodących związków (hit-to-lead). Metoda ta zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania leków poprzez powiązanie efektów działania związków z funkcjonalną aktywnością kanałów w fizjologicznie istotnym kontekście komórkowym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez pomiar funkcjonalnej modulacji kanałów GIRK w odpowiedzi na ligandy GPCR.
- Wartość operacyjna: Umożliwia szybkie przesiewanie bibliotek związków w celu identyfikacji aktywatorów lub inhibitorów o specyficzności mechanistycznej.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka związanego z celem terapeutycznym poprzez potwierdzenie aktywności on-target na podstawie zmian sygnału fluorescencji skorelowanych z odpływem K+.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość testu: Wykorzystuje barwniki wrażliwe na potencjał błonowy (DiBAC4(3) lub HLB 021-152) do generowania mierzalnych sygnałów w czasie rzeczywistym po aktywacji GIRK.
- Powtarzalność: Obliczanie współczynnika Z (zakres doskonały: 0,5–1,0) zapewnia wysoką solidność testu w celu wyboru hitów i powtarzalności kampanii.
- Skalowalność: Kompatybilność z formatem 96-dołkowym oraz systemami do manipulacji cieczami (np. Verset) w celu zautomatyzowanego dozowania związków i przesiewania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście chorób: Zidentyfikowane modulatory mogą dostarczyć informacji o strategiach terapeutycznych w leczeniu bólu neuropatycznego, uzależnień oraz arytmii serca poprzez zależne od kanałów GIRK hamowanie neuronów.
- Ciągłość translacyjna: Odczyty fluorescencyjne stanowią pomost między oddziaływaniem na cel a wynikiem funkcjonalnym, co wspiera zakotwiczenie fenotypu w badaniach przedklinicznych.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Specyficzność potwierdzono przy użyciu inhibitorów, takich jak chlorek baru lub Terapin Q, aby odróżnić efekty zależne od GIRK od aktywności pozacelowej.
Integracja potoków i przepływów pracy
Test ten wpisuje się w proces badawczy obejmujący etap od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, umożliwiając funkcjonalny screening modulatorów GIRK przed dalszą optymalizacją.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez powiązanie aktywacji GPCR ze zmianami fluorescencji zależnymi od GIRK, co pozwala na wyjaśnienie modulacji szlaków.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanemu wprowadzaniu barwnika, aplikacji związków oraz pomiarowi kinetyki fluorescencji przez 300 sekund.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennej zależnej (stosunki intensywności fluorescencji), umożliwiając porównanie siły działania i skuteczności związków.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez identyfikację związków zmieniających pobudliwość neuronów za pośrednictwem GIRK, co ma znaczenie dla modeli bólu i uzależnień.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Platforma jest adaptowalna dla różnych linii komórkowych i ligandów GPCR, co sprzyja ponownemu wykorzystaniu w wielu kampaniach walidacji celów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w zakresie modulacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w przesiewaniu leków wpływających na kanały jonowe.
- Wartość operacyjna: Oferuje standaryzację, powtarzalność oraz kinetyczne dane w czasie rzeczywistym, które są nieosiągalne w testach punktowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez umożliwienie wczesnej walidacji funkcjonalnej, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach z powodu braku oddziaływania na cel.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację związków z potwierdzoną aktywnością GIRK w oparciu o analizę ryzyka w celu ich przejścia do etapu optymalizacji wiodących struktur.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza w zakresie hodowli komórkowych (komórki AT T20), pracy z barwnikami fluorescencyjnymi oraz obsługi kinetycznego czytnika płytek.
- Metoda zależy od dostępności czytnika fluorescencji z funkcją wtryskiwania (np. Synergy 2) oraz odpowiednich ustawień wzbudzenia/emisji (520 nm/560 nm).
- Niezbędna jest standaryzacja ładowania barwnika, czasów inkubacji oraz warunków buforowych we wszystkich studzienkach i płytkach.
- Adaptacja do innych linii komórkowych wymaga walidacji ekspresji GIRK oraz wydajności ładowania barwnika.
- Ograniczenie praktyczne: Specyficzność testu musi zostać potwierdzona przy użyciu inhibitorów ortogonalnych (np. Ba2+, Terapin Q), aby wykluczyć zmiany fluorescencji niezwiązane z kanałami GIRK.
