Myszy transnuklearne o zdefiniowanej specyficzności receptorów limfocytów T przeciwko Toxoplasma gondii uzyskane poprzez SCNT

Myszy transgeniczne z antygenowo swoistymi receptorami limfocytów T są niezbędne w badaniach nad rozwojem i funkcją limfocytów T w celu generowania modeli mysich o zdefiniowanej swoistości receptorów limfocytów T z wykorzystaniem transferu jąder komórek somatycznych lub SCNT. Myszą zaraża się wybrany patogen. Następnie izoluje się limfocyty T z organizmu myszy, a następnie oczyszcza je za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją.

Oczyszczone limfocyty T są następnie wykorzystywane do transferu jąder komórek somatycznych. Po osiągnięciu przez embriony stadium blastocysty izolowane są embrionalne komórki macierzyste. Komórki te są następnie wstrzykiwane do blastocyst, które są transferowane do myszy w stanie pseudociąży.

W wyniku otrzymane szczenięta wykazują wyraźny wzrost zainteresowanej populacji limfocytów T, co można potwierdzić za pomocą analizy PAX. Witajcie, nazywam się Okta AK i jestem pracownikiem postdoktorem w Instytucie Badań Biomedycznych White. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzić somatyczne zastrzyki wspomagające blastocyty z transferem CLE, a także transfer embrionów.

Główną zaletą transferu somatycznego jest możliwość szybkiego generowania modeli mysich, które wykazują ekspresję receptora limfocytów T z locus endogennego, a tym samym pod kontrolą promotora endogennego. Somatyczny transfer w formie płynnej może służyć jako narzędzie do tworzenia modeli mysich o zdefiniowanej specyficzności receptora limfocytów T lub receptora limfocytów B. Jest to szczególnie interesujące dla badaczy zajmujących się takimi dziedzinami jak autoimmunologia, choroby zakaźne oraz nowotwory.

W celu izolacji limfocytów T specyficznych dla patogenu, takiego jak Toxoplasma gondii, myszy zainfekowano drogą doglebową w szczycie odpowiedzi immunologicznej. Śledzionę wyizolowano z uśpionej myszy, a następnie wyizolowano homogenizat komórek dawcy i inkubowano go z przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie oraz odpowiednim tetramerem. Na koniec przeprowadzono sortowanie komórek w celu uzyskania limfocytów T specyficznych dla patogenu. Wieczorem przed procedurą enukleacji oocytów.

Przygotować igły do iniekcji piso o średnicach czterech, pięciu i siedmiu mikrometrów, wykorzystując strzykawkę do ich wstecznego napełnienia rtęcią. Następnego dnia rozpocząć protokół transferu jąder komórek somatycznych od pobrania oocytów, a następnie za pomocą pipety ustnej przenieść je do kropel pożywki K-S-O-M-A-A w szalce Petriego. W pokrywce szalki Petriego.

Przygotuj płytkę do wykonania transferu jąder komórek somatycznych lub SCNT, nakładając około 10 kropli PVP, około 10 kropli HCZB zawierającego 5 µg/mL cyto B oraz około 10 kropli HCCB zawierającego 2,5 µg/mL cyto B. Płytka ta będzie określana jako płytka S-C-N-T-A. Umieść płytkę S-C-N-T-A na stoliku odwróconego mikroskopu złożonego.

Następnie umieść igłę do enukleacji o średnicy 7 µm w mikromanipulatorze i przemyj ją, pobierając i odrzucając roztwór PVP od 5 do 10 razy. Następnie przenieś od 10 do 30 oocytów zatrzymanych w metafazie II z płytki Petri do jednej z kropel HCCB z 5 µg/mL Cyto B na płytce S-C-N-T-A; inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a w trakcie inkubacji ustaw oocyty poziomo.

Po upływie pięciu minut należy użyć igły do enukleacji, aby umieścić oocyt przed igłą trzymającą. Za pomocą mikroinkubatora należy zastosować podciśnienie, aby przymocować oocyt do mikropipety igły trzymającej.

Następnie, używając igły do enukleacji, obracaj oocyt, aż kompleks wrzeciona chromosomowego, który w porównaniu do oplazmy wydaje się hiperprzezroczysty, znajdzie się na pozycji godziny trzeciej, a następnie zainicjuj impuls piezoelektryczny, naciskając pedał, aby przebić zno lucita. Impuls piezoelektryczny to impuls mechaniczny, który rozchodzi się wzdłużnie i powoduje wibracje końcówki igły do enukleacji. Wibracje końcówki ułatwiają przebicie się przez zop lucita.

Po przebiciu błony przejrzystej należy umieścić otwór igły do nukleacji obok wrzeciona metafazy II i zastosować podciśnienie. Kompleks wrzeciona chromosomowego powoli przesunie się do wnętrza igły. Po wyjęciu igły błona powinna ulec samouszczelnieniu.

Na koniec, za pomocą pipety ustnej, przenieś enukleowane cyty z powrotem do kropel K-S-O-M-A-A. Następnie, używając tej samej pipety, przemyj je, przenosząc je z kropli do kropli KSOM AA. Aby przeprowadzić transfer jądra, wymień igłę do enukleacji o średnicy 7 µm w mikromanipulatorze na igłę do transferu jądra o średnicy od 4 do 5 µm. Przemyj igłę PVP w taki sam sposób jak poprzednio.

Nanieś osiem wyizolowanych wcześniej pozytywnych limfocytów T CD w kropli PVP na płytkę S-C-N-D-A. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś od 10 do 30 ENUCLEATED cytes w kropli HCZB z stężeniem 2,5 micrograms per milliliter.

Inkubować Cyto B na płytce S ct. przez pięć minut w temperaturze pokojowej. W czasie inkubacji ułożyć cyty poziomo, używając do tego igły do transferu jąder oraz igły do iniekcji.

Pobierz komórkę dawcy CD8+ z pożywki PVP i aspiruj ją wielokrotnie, aż błona zewnętrzna ulegnie rozpadowi. W razie potrzeby zastosuj impuls piezoelektryczny; widoczne powinny być fragmenty błony i cytozolu. Wciągnij jądro komórkowe do igły.

Następnie kontynuuj pobieranie jąder, aż zostanie od 10 do 30 sztuk. Dalej przejdź do kropli zawierającej wyrównane enukleowane oocyty. Zastosuj podciśnienie, aby przymocować jeden oocyt do igły trzymającej.

Następnie należy umieścić igłę do transferu jąder NU obok zop lucita, tak aby jądra były skierowane w stronę przeciwną do otworu. Stosuj impulsy piezoelektryczne, aż igła przejdzie przez zop lucita. Używając mikromanipulatora, ostrożnie przesuń jedno jądro na czubek igły.

Wsuń igłę do oocyta, aż jej końcówka znajdzie się w dwóch trzecich jego szerokości. Zastosuj niewielkie podciśnienie, aby fragment błony oocyta znalazł się wewnątrz igły. Następny krok jest krytyczny.

Ponieważ jest to jedyny moment, w którym oocyt jest faktycznie otwarty, należy podać pojedynczy impuls ZO. Następnie należy zastosować nadciśnienie, aby wypchnąć jądro komórkowe z igły.

Ostrożnie wycofaj igłę tak, aby jej końcówka znajdowała się w około jednej trzeciej głębokości oocyta, następnie przyłóż podciśnienie i kontynuuj wycofywanie igły, aby uszczelnić oocyt. Powtórz ten krok dla każdego oocyta.

Po tym, jak wszystkie oocyty otrzymają jądro, przenieś je do szalki Petriego i wypłucz, przenosząc je z kropli do kropli medium KS OM AA inkubowanego w temperaturze 37°C przez co najmniej 30 minut. Po inkubacji przenieś embriony SCN T do kropli medium aktywującego wolnego od wapnia, zawierającego chlorek strontu. Chlorek strontu aktywuje oocyt poprzez indukcję oscylacji wapnia, które występują w podobny sposób podczas zapłodnienia.

Inkubować przez sześć godzin. W razie potrzeby do pożywki aktywacyjnej dodać TSA, który jest nieswoistym inhibitorem deacetylazy histonowej. Aby ocenić wydajność po aktywacji, zbadać embriony pod mikroskopem odwróconym w celu określenia liczby pseudojąderek lub embrionów SCNT dodatnich pod kątem PPN. PPN można zidentyfikować na podstawie ich wyglądu.

Wyglądają jak jaja. Mycie i hodowla „na słoneczną stronę”. Zarodki i krople K-S-O-M-A-A przez trzy i pół dnia w temperaturze 37 °C, aż osiągną stadium blastocysty.

Na początku należy skupić się na prawidłowym wykonaniu zaprezentowanych wcześniej procedur nukleacji oraz transferu jąder NU. Po opanowaniu tych technik łatwiej będzie przeprowadzić kolejne etapy. Wykorzystane embrionalne komórki macierzyste (ES) zostały wyhodowane przy użyciu standardowych metod.

Należy przygotować je w dniu wstrzyknięcia wspomaganego blastem, trzy i pół dnia po kopulacji. Przygotuj pokrywkę sterylnej szalki bakteriologicznej, nakładając krople zawierające PVP oraz HCZP. Następnie przygotuj igłę wstrzykiwającą o średnicy 15 mikrometrów do impulsu piso, analogicznie jak poprzednio.

Następnie umieść igłę do iniekcji w mikromanipulatorze i przemyj ją, wykonując od 10 do 30 impulsów w kropli HCZB. Następnie nanieś od 5 do 50 µL zawiesiny ESL do drugiej kropli HCZB.

Liczba komórek ES powinna być taka, aby można było je łatwo pobrać, lecz nie powinny być one zbyt gęsto rozmieszczone. Następnie, za pomocą igły do mikroiniekcji, pobierz od 30 do 100 komórek ES. Przenieś je do kropli z blast assist.

Ustaw uchwyt do blastocysty poziomo i unieruchom go za pomocą igły mocującej, stosując podciśnienie. Użyj igły do iniekcji, aby obracać uchwyt, aż masa komórkowa wewnętrzna znajdzie się na godzinie dziewiątej. Umieść igłę do iniekcji na godzinie trzeciej.

Upewnij się, że na końcówce igły nie znajdują się żadne komórki ES, a następnie przykładaj impulsy piezoelektryczne, aż igła wstrzykująca przebije zonę pellucida i trofektodermę, docierając do jamniowej blastocysty. Wprowadź od pięciu do 15 komórek ES w taki sposób, aby przywarły do wewnętrznej masy komórkowej. Kontynuuj proces, aż wszystkie blastocysty zostaną zainfekowane. Po zakończeniu iniekcji.

Przemyć dwukrotnie w K-S-O-M-A-A, a następnie przystąpić do chirurgicznego transferu embrionów do pseudyciążnych samic. Umieścić zanurkowaną w znieczuleniu mysz biorczynę w stanie pseudo-ciąży w obszarze operacyjnym. Za pomocą golarki elektrycznej usunąć sierść z prawego dolnego kwadrantu. Zdezynfekować ten obszar, używając roztworu na bazie jodu oraz 70% etanolu pod mikroskopem stereoskopowym.

Za pomocą nożyczek rozciąć skórę, następnie wprowadzić zamknięte nożyczki pomiędzy skórę a otrzewną i rozchylić je, aby oddzielić otrzewną od skóry. Zlokalizować jajnik przez otrzewną; powinien on być widoczny jako czerwona plamka. Następnie za pomocą nożyczek rozciąć otrzewną w tym obszarze.

Używając pęsety, ostrożnie chwyć UCT lub otaczającą tkankę tłuszczową i wyciągnij macicę za pomocą kapilary połączonej z pipetą ustną. Pobierz grupę około 10 blastocyst, trzymając jajowód i macicę pęsetą. Użyj igły, aby nakłuć mały otwór w macicy.

Następnie wprowadź kapilarę z blastocystą do światła macicy i zwolnij ją. Wsuń macicę z powrotem do jamy brzusznej. Zlokalizuj brzegi otrzewnej i zamknij je za pomocą kilku szwów.

Zamknąć skórę myszy za pomocą kilku zszywek. Podać podskórnie lek przeciwbólowy. Następnie przenieść mysz z powrotem do klatki pod lampę grzewczą.

Monitoruj oddychanie myszy aż do momentu jej wybudzenia. Po enukleacji i transferze jąder komórek somatycznych około 70% embrionów wykazało obecność pseudojąderek.

Jak pokazano na tej rycinie. Leczenie TSA przez 6 lub 10 godzin nie wywołało żadnego efektu. Po trzech i pół dniach hodowli od 5 do 10% embrionów przekształciło się w blastocysty.

Ponownie, dodatek TSA nie wpłynął na tempo rozwoju blastocyst. Blastocysty uzyskane metodą SCNT wykorzystano następnie do wyprowadzenia embrionalnych komórek macierzystych. TSA znacząco poprawiło odsetek uzyskania ESL z blastocyst.

Komórki S-C-N-T-E-S są wykorzystywane do generowania myszy chimerycznych. Z myszy tych pobiera się krew i analizuje pod kątem obecności specyficznych limfocytów T przy użyciu analizy FACS, zgodnie z przedstawioną procedurą. Po zabarwieniu krwi przeciwciałem anty-CDA oraz specyficznym tetramerem można zidentyfikować populację podwójnie dodatnią.

Wskazuje to, że komórka dawcy wykorzystana do SCNT miała odpowiednią specyficzność. Przedstawiłem właśnie sposób przeprowadzania transferu LU z komórek somatycznych, iniekcji wspomagających blastocysty oraz transferu zarodków. Najważniejszym punktem do rozważenia jest czystość populacji limfocytów T lub B.

Po opanowaniu techniki transferu somatycznego i uzyskaniu embrionów w stadium blastocysty, można zdecydować o ich bezpośrednim transferze do samic w stanie pseudociąży lub wykorzystaniu ich do wyodrębnienia embrionalnych komórek macierzystych oraz generowania myszy chimerycznych.