Ocena rozkładu przestrzennego $\gamma$H2AX po napromieniowaniu jonizującym
7 sierpnia 2010
Analiza mikroskopowa ognisk γH2AX, które tworzą się po fosforylacji H2AX w Ser-139 w odpowiedzi na pęknięcia dwuniciowe DNA, stała się nieocenionym narzędziem w radiobiologii. W niniejszej pracy wykorzystaliśmy przeciwciało przeciwko monometylowanej histonie H3 w lizynie 4 jako marker epigenetyczny aktywnie transkrybowanej euchromatyny, aby ocenić przestrzenną dystrybucję powstawania indukowanych promieniowaniem ognisk γH2AX w jądrze komórkowym.
Witam, nazywam się Raja Ti i przygotowuję doktorat w Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Przeprowadzę Państwa przez kolejne etapy 3D ilustracji modyfikacji epigenetycznej, która oznacza uszkodzenie DNA i kondensację chromatyny w komórce kardiomiocytu. DNA jest owinięte wokół nukleosomów.
Każdy nukleosom składa się z czterech różnych typów histonów: H2A, H2B, H3 i H4. Powstawanie pęknięć DNA jest sygnalizowane przez fosforylację H2AX. Fosforylacja H2AX zachodzi głównie w chromatynie, która jest znakowana metylacją H3K4. Teraz przyjrzymy się ilustracji 3D modyfikacji w komórce, oznakowanej immunochemicznie dla fosfo-H2AX oraz metylowanego H3K4.
Zacznijmy. Rozpoczynamy od przelania zawiesiny komórkowej do probówek Falcon 15 ml. Następnie przemywamy je dwukrotnie w PBS, wirując przy 150 g i ponownie resuspendując.
Zawiesić w świeżym medium, aby zaobserwować bezpośredni wpływ promieniowania na procesy komórkowe. Utrzymywać komórki na oczach przez 5 do 10 minut przed i w trakcie napromieniowania. Poddać komórki działaniu promieniowania gamma lub promieniowania rentgenowskiego. Po naświetleniu rozdzielić po 3 ml zawiesiny komórkowej do każdego z sześciu GU.
Płytka wielodołkowa do wyznaczenia szczytu poziomu gamma H2AX; inkubować komórki od 30 minut do jednej godziny w temperaturze 37 °C. Używamy Cytospin do osadzania nieprzywierających komórek na szkiełkach przedmiotowych. Podczas montażu zestawu do Cytospinu należy upewnić się, że krawędź całego filtra pokrywa się z lejkiem.
Odmiarzyć 50 µL zawiesiny komórkowej i nanieść ją na każde szkiełko cytospinowe. Umieścić szkiełka w wirówce do cytospinacji i wirować z prędkością 500 RPM przez pięć minut. Wyjąć szkiełka i oddzielić je od karty filtracyjnej. Nie dopuszczać do zbyt długiego wysychania komórek na powietrzu, ponieważ może to wpłynąć na tło podczas barwienia fluorescencyjnego.
Używając płynnego znacznika do blokowania, obrysowujemy okręgi wokół każdego rozmazu, a następnie utrwalamy komórki w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej przez pięć minut. W porównaniu z etanolem lub olejem, lepszą utrwalenie zaobserwowano przy użyciu 4% paraformaldehydu. Przeszkła z PPS permeabilizujemy komórki za pomocą Triton X 100 w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
W porównaniu do twin 80, zaobserwowaliśmy lepszy sygnał w komórkach z zastosowaniem Triton X 100. Obserwowano komórki z PP S3 trzykrotnie po pięć minut każdorazowo. Komórki blokowano w 1% BSA przez 10 minut w temperaturze pokojowej, powtarzając ten proces trzykrotnie w porównaniu z innymi środkami blokującymi i czasami inkubacji.
BSA okazała się najskuteczniejsza w minimalizowaniu niespecyficznego wiązania przeciwciał pierwszorzędowych. Użyliśmy dwóch przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych 1:500 w 1% BSA, stosując około 50 µL przeciwciała pierwszorzędowego na każdy preparat. Inkubacja przeciwciał pierwszorzędowych w temperaturze pokojowej przez 60 minut zmniejsza tło w porównaniu z inkubacją nocną w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki trzy razy w PBS przez pięć minut.
Alexa Fluor 488 jest dobrym przeciwciałem anty-mysim, a Alexa Fluor 546 przeciwciałem anty-króliczym. Przeciwciała wtórne zastosowano w celu jednoczesnego wykrycia różnych markerów. Należy użyć przeciwciał wytworzonych w różnych gatunkach.
Nanieś około 50 µL rozcieńczonego przeciwciała wtórnego na każdy preparat. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Zaleca się inkubację komórek w komorze wilgotnościowej, aby zapobiec wysychaniu komórek i przeciwciał. Przemyj preparaty PBS 3 razy, każdorazowo przez pięć minut.
50 µL rozcieńczenia 1:500 topo three w PBS dodano do każdego slajdu. Slajdy przemywano PBS-em trzykrotnie, za każdym razem przez pięć minut. Usunięto nadmiar wilgoci ze slajdów i dodano roztwór Antifa.
Zaleca się, aby nie wysuszać komórek całkowicie przed dodaniem roztworu Antifa. Na szkiełko przedmiotowe nałożyć szkiełko nakrywkowe. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.
Pozostawić preparaty na noc w ciemnej, wilgotnej komorze. Zabezpieczyć preparat lakierem do paznokci, aby zapobiec wysychaniu komórek. Obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu konfokalnego ujawniają.
W celu uzyskania lepszej rozdzielczości przestrzennej do akwizycji obrazów wykorzystano laser helowy. Wybrano obiektywy imersyjne 63x zamiast obiektywów o wyższym lub niższym powiększeniu. Zastosowanie trzykrotnego lub czterokrotnego zoomu pozwoli uzyskać obraz o lepszej rozdzielczości.
W przypadku obrazowania FO z wielu komórek zaleca się stosowanie prędkości skanowania wynoszącej osiem oraz rozmiaru obrazu 1024 na 1024 piksele na komórkę. Podczas obrazowania w wielu kanałach zaleca się sekwencyjne pozyskiwanie skanów liniowych zamiast skanowania ramkowego. Aby uniknąć blaknięcia próbki, wzmocnienie detektora i offset wzmacniacza zostają dostrojone w celu zredukowania szumów oraz nasycenia sygnału.
Ponieważ rozmiar Kama HX X four może być mniejszy niż 0,5 µm, zaleca się pozyskiwanie obrazów o rozdzielczości co najmniej 0,5 µm. W przypadku serii obrazów wzdłuż osi strumienia, wymagany jest krok obrazowania w układzie seryjnym z wykorzystaniem wzorca mark first oraz mark lost. Aby zobrazować relacje przestrzenne między różnymi białkami, zaleca się zastosowanie prędkości skanowania 6 przy rozmiarze obrazu 2048 na 2048 pikseli z wykorzystaniem metamor first.
Po drugie, zliczenia można przeprowadzić na obrazach uzyskanych za pomocą różnych mikroskopów konfokalnych. Otwórz tagi obrazów gamma hgx bezpośrednio z menu plików lub korzystając z numerów rachunków. Przejdź do menu procesów i wybierz Arytmetykę stosu.
Wybierz opcję maksymalnej projekcji (maximum projection) i zaznacz płaszczyzny, które mają zostać uwzględnione. Następnie kliknij OK. Teraz wybierz funkcję top hat i wskaż obraz Gamma H two X jako obraz źródłowy, a następnie zatwierdź wybór.
Filtr top-hat oraz wynikowy obraz będą obrazami binarnymi o mniejszym poziomie szumów i zredukowanej zmienności intensywności ognisk. Przejdź do zakładki regions, wybierz narzędzie do rysowania obszarów (region drawing tool) i obrysuj jądra komórkowe. Przejdź do menu process i wybierz opcję sell threshold image.
Wybierz próg włączenia i ustaw wartości progu dolnego oraz górnego. Zazwyczaj to właśnie wartości progowe wpływają na cztery liczby. Optymalny próg to taki, który minimalizuje włączenie tła i maksymalizuje włączenie obiektów.
Najlepiej osiągnąć to poprzez zliczenie liczby wypustek (foray) przy użyciu różnych wartości progowych. Następnie należy porównać liczbę wypustek z wynikiem liczenia „gołym okiem”. Wybierz obraz DPI, przejdź do menu obszarów (regions) i wybierz opcję przesyłania obszarów (transfer regions).
Obecnie mamy przygotowane odpowiadające sobie obrazy z obszarów zainteresowania oraz obrazy jąder do zliczenia. Większość regionów jądrowych została przeniesiona do funkcji top hat. Przejdź do menu Measure (Pomiar) i wybierz Integrated Ary Analysis lub IMA. Zaznacz Measure all regions (Pomierz wszystkie regiony) i kliknij Measure (Pomierz), aby uzyskać liczbę FTE.
Teraz wartości FTE z każdego regionu można wyeksportować do arkusza kalkulacyjnego, korzystając z opcji Log data. Otwórz wcześniej utworzone obrazy z projektora jet dla każdego kanału. Przejdź do menu display i wybierz color align.
Wybierz odpowiednie obrazy źródłowe dla każdego kanału, aby stworzyć obraz zbiorczy dla wszystkich trzech kanałów. Analiza skanowania liniowego jest przeprowadzana w celu zilustrowania rozmieszczenia przestrzennego różnych markerów w jądrze komórkowym. Przejdź do paska narzędzi pomiarowych, wybierz polecenie analizy skanowania liniowego i poprowadź linię przez komórkę.
W ten sposób zostanie utworzony wykres przedstawiający intensywność fluorescencji każdego kanału wzdłuż linii, co obrazuje odległość poszczególnych markerów względem siebie. Aby utworzyć obraz 3D ze stosu obrazów, przejdź do menu stack i wybierz 3D reconstruction. Jako typ rekonstrukcji 3D wybierz maximum.
Wybierz płaszczyznę rotacji oraz odległość kalibracji strumienia. Zazwyczaj użytkownik zatwierdza wybór, klikając „OK”, aby utworzyć rekonstrukcję 3D. To kończy nasz protokół dotyczący immunofluorescencji, barwienia i analizy obrazu.
Podsumowując, mikroskopia konfokalna z immunofluorescencją to dwie techniki służące do trójwymiarowej wizualizacji różnych markerów C oraz ognisk gamma H2AX w jądrze komórkowym. Dziękujemy za uwagę.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na analizie ognisk γH2AX, które są kluczowymi wskaźnikami pęknięć dwuniciowych DNA w biologii radiacyjnej. Wykorzystując przeciwciało przeciwko monometylowanej histonie H3 w lizynie 4, w pracy oceniono przestrzenną dystrybucję formowania się γH2AX w jądrze komórkowym po ekspozycji na promieniowanie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia radiacyjna
- Odpowiedź na uszkodzenia DNA
- Epigenetyka
Wstęp
- Tworzenie się ognisk γH2AX jest odpowiedzią na uszkodzenia DNA.
- Fosforylacja H2AX w obrębie Ser-139 jest kluczowym markerem.
- Monometylacja histonu H3 przy lizynie 4 wskazuje na aktywną transkrypcję.
- Zrozumienie rozkładu przestrzennego uszkodzeń DNA jest kluczowe dla badań nad promieniowaniem.
Cel badania
- Analiza powstawania ognisk γH2AX w odpowiedzi na promieniowanie.
- Ocena roli markerów epigenetycznych w odpowiedzi na uszkodzenia DNA.
- Wizualizacja przestrzennego rozkładu tych markerów wewnątrz jądra komórkowego.
Zastosowane metody
- Analiza mikroskopowa ognisk γH2AX.
- Zastosowanie przeciwciał do detekcji monometylowanej histony H3.
- Techniki ilustracji 3D do wizualizacji modyfikacji jądrowych.
- Ocena efektów indukowanych promieniowaniem w strukturze chromatyny.
Główne wyniki
- Identyfikacja ognisk γH2AX jako markerów pęknięć dwuniciowych DNA.
- Demonstracja przestrzennego rozkładu tych ognisk w jądrze komórkowym.
- Korelacja między modyfikacjami histonów a aktywnością transkrypcyjną.
- Wgląd w krajobraz epigenetyczny po ekspozycji na promieniowanie.
Wnioski
- Ogniska γH2AX stanowią skuteczne wskaźniki uszkodzeń DNA.
- Modyfikacje histonów dostarczają cennych informacji o stanie chromatyny.
- Badanie to pogłębia zrozumienie odpowiedzi komórkowej na promieniowanie.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie przestrzennego rozkładu markerów uszkodzeń DNA, takich jak γH2AX, dostarcza mechanistycznych informacji o kontekście chromatyny i aktywności transkrypcyjnej po ekspozycji na promieniowanie. Podejście to wspiera walidację celu poprzez powiązanie stanów epigenetycznych ze szlakami naprawy DNA, co pozwala na uzyskanie wiarygodnych wyników prognostycznych w przedklinicznych modelach stresu genotoksycznego. Metoda ta usprawnia opracowywanie testów do przesiewowego wyznaczania związków modyfikujących działanie promieniowania poprzez kwantyfikację formowania się ognisk w określonych przedziałach jądrowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez korelację ognisk γH2AX z aktywną euchromatyną znakowaną metylacją H3K4.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną ocenę ryzyka dzięki rozdzielczości przestrzennej uszkodzeń DNA w transkrypcyjnie istotnych regionach chromatyny.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję portfolio poprzez identyfikację związków modyfikujących odpowiedzi na uszkodzenia DNA zależne od chromatyny.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszego przesiewu poprzez standaryzację detekcji ognisk oraz ich kolokalizacji z markerami epigenetycznymi.
- Wynik ilościowy: Dostarcza powtarzalne, oparte na obrazowaniu odczyty tworzenia się ognisk γH2AX oraz ich rozkładu przestrzennego w komórkach nieprzywierających.
- Znaczenie dla przesiewu: Wspiera rzetelną ocenę związków poprzez umożliwienie wysokoprzepustowej analizy uszkodzeń DNA w systemach uwzględniających kontekst chromatyny.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy wczesne sygnalizowanie uszkodzeń DNA z walidacją przedkliniczną poprzez dopasowanie biomarkerów specyficznych dla stanu chromatyny.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Koncentruje się na wartości prognostycznej, wyjaśniając, w jaki sposób aktywność transkrypcyjna wpływa na rozprzestrzenianie się γH2AX po napromieniowaniu.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), ujawniając różnice w naprawie uszkodzeń pomiędzy euchromatyną a heterochromatyną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną, w szczególności w zakresie przesiewania związków genotoksycznych i badań mechanistycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez ujawnianie przestrzennych wzorców uszkodzeń DNA w odniesieniu do aktywności transkrypcyjnej.
- Przesiewanie: Poprawia powtarzalność testów oraz ilościowy pomiar ognisk w celu oceny efektów działania związków.
- Analityka: Dostarcza zintegrowane dane dotyczące intensywności i rozkładu przestrzennego, umożliwiając analizę porównawczą warunków.
- Badania translacyjne: Łączy z ciągłością przedkliniczną poprzez dopasowanie biomarkerów epigenetycznych w modelach odpowiedzi na promieniowanie.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania i analizy do badań uszkodzeń DNA w kontekście chromatyny.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w lokalizacji uszkodzeń DNA.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, powtarzalność i skalowalność w kwantyfikacji ognisk oraz analizie kolokalizacji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), zwiększa efektywność kapitałową i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach programów genotoksykologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zależne od chromatyny fenotypy uszkodzeń i naprawy DNA.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie immunofluorescencji, mikroskopii konfokalnej oraz detekcji markerów epigenetycznych.
- Metoda jest zależna od aparatury umożliwiającej rekonstrukcję 3D, analizę skanowania liniowego oraz przetwarzanie obrazów w oparciu o wartości progowe.
- Niezbędna jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie walidacji przeciwciał, parametrów obrazowania oraz protokołów liczenia ognisk.
- Konieczne jest uwzględnienie adaptacji metody dla różnych typów komórek, w szczególności dla modeli komórek pierwotnych i nieprzywierających.
- Ograniczenia praktyczne obejmują rozdzielczość sygnału dla ognisk poniżej mikrometra oraz potencjalne blaknięcie fluorescencji podczas akwizycji wielokanałowej.
