Wykrywanie i identyfikacja bakterii z wykorzystaniem czujników elektrochemicznych

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykrywanie i identyfikacja bakterii przy użyciu czujników elektrochemicznych. Osiąga się to poprzez najpierw uwalnianie rybosomalnego RNA z bakterii w celu umożliwienia hybrydyzacji z fluorowaną sondą detekcyjną, a w drugim kroku dodanie do elektrody roboczej rybosomalnego RNA związanego z sondą detekcyjną, co pozwala na hybrydyzację z sondą wychwytującą na powierzchni czujnika. Następnie umożliwia się związanie koniugatu przeciwciała antyfluoresceina-peroksydaza chrzanowa z fluorowaną sondą detekcyjną.

Wreszcie, można uzyskać prąd interferometryczny, którego natężenie jest skorelowane z liczbą kompleksów sondy wychwytującej, rybosomalnego RNA i sondy detekcyjnej na powierzchni czujnika. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodami opartymi na hodowlach jest możliwość wykrycia i identyfikacji bakterii w około 45 minut, co pozwala uniknąć oczekiwania przez całą noc, aż bakteria utworzy widoczną kolonię na płytce EDGAR. Zastosowanie tej techniki mogłoby usprawnić leczenie chorób zakaźnych.

Wczesne wykrywanie patogenów bakteryjnych jest niezbędne dla celowanej terapii antybiotykowej i poprawy wyników klinicznych. Choć metoda ta jest przydatna w diagnostyce chorób zakaźnych, może ona zostać zastosowana również w innych problemach diagnostycznych, takich jak immunodiagnostyka. Należy rozpocząć od inkubacji rozcieńczonej sondy wychwytującej z heksanoditiolem przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby zapewnić redukcję grupy tiolowej na sondzie wychwytującej, co pozwoli na uzyskanie bardziej spójnych wyników.

Po inkubacji skieruj strumień azotu na chipy z matrycą 16 czujników złota przez pięć sekund, aby usunąć wilgoć lub zanieczyszczenia stałe. Małe objętości cieczy należy ostrożnie nanosić na elektrodę roboczą w matrycy czujników. Kluczowa jest wizualna prezentacja tej techniki.

Prawidłowe wykonanie technik pipetowania, płukania i suszenia znacznie redukuje zmienność między poszczególnymi chipami. Następnie nanieś 6 µL mieszaniny rozcieńczonej sondy wychwytującej HDT na elektrodę roboczą każdego z 16 sensorów w macierzy sensorowej i przechowuj chipy sensoryczne w przykrytej płytce Petri w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia przemyj chipy sensoryczne wodą dejonizowaną przez 2–3 s, a następnie osusz chipy strumieniem azotu przez 5 s. Teraz nanieś 6 µL roztworu chlorku attri, chlorku sodu, EDTA i mercaptoetanolu na elektrodę roboczą każdego z 16 sensorów i inkubuj sensory przez 50 min w płytce Petri w temperaturze pokojowej.

W celu przygotowania próbek do analizy za pomocą czujnika elektrochemicznego, przenieś 1 mL kultury bakterii w logarytmicznej fazie wzrostu do probówki do mikrocentryfugi, a następnie wiruj komórki przez 5 minut przy 16 000 g. Należy pamiętać, że bakterie patogenne powinny być przetwarzane w komorze z laminarnym przepływem powietrza (dygestorium biologicznym).

Po usunięciu snatu, nanieś za pomocą końcówki pipety 10 µL 1 M wodorotlenku sodu na dno probówki do mikrocentryfugi i pipetuj w górę i w dół kilka razy, aby dokładnie resuspendować osad. Po inkubowaniu zawiesiny w temperaturze pokojowej przez pięć minut, dodaj 50 µL PBS zawierającego albuminę surowicy bydlęcej (BSA) oraz modyfikowaną fluoresceiną sondę detekcyjną, aby zneutralizować lizat bakteryjny. Następnie inkubuj zneutralizowany lizat przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Krok ten należy rozpocząć od przemycia jednego z przygotowanych chipów sensorycznych wodą dejonizowaną, aby usunąć roztwór merkaptoetanolu, przez dwie do trzech sekund. Po wysuszeniu chipu w sposób przed chwilą zademonstrowany, należy nanieść 4 µL zneutralizowanego lizatu bakterii na elektrody robocze 14 sensorów.

Następnie nanieś 4 µL oligonukleotydu mostkującego w PBS z dodatkiem BSA oraz fluoresceinowo zmodyfikowanej sondy detekcyjnej na dwa sensory kontrolne dodatnie. Po inkubacji lizatu oraz sensorów kontrolnych dodatnich przez 15 minut, przemyj, a następnie wysusz cały chip sensoryczny w sposób opisany wcześniej. Teraz nanieś 4 µL antyfluoresceiny z peroksydazą chrzanową (HRP) w PBS zawierającym kazeinę na elektrody robocze wszystkich 16 sensorów.

Po 15-minutowej inkubacji należy przemyć i osuszyć chip sensoryczny. Następnie na powierzchnię chipa nałóż naklejkę do tworzenia studzienek, a chip umieść w uchwycie. Napełnij wszystkie 16 sensorów 50 µL substratu TMB i zamknij uchwyt chipa. Na koniec użyj czytnika chipów Helios, aby uzyskać pomiary pyrometryczne i telemetrię cykliczną dla wszystkich 16 sensorów.

Opisany powyżej test elektrochemiczny jest skonstruowany podobnie do testu typu kanapkowego ELISA, jak pokazano na tej ilustracji; hybrydyzacja docelowego rybosomalnego RNA z sondami wychwytującymi i detekcyjnymi jest wykrywana poprzez reakcję redoks katalizowaną przez HRP sprzężone z fragmentami przeciwciał antyfluoresceinowych, które wiążą łącznik fluoresceiny w pozycji 3' sondy detekcyjnej. Ważnym elementem czułości testu jest chemia powierzchni elektrody złotej. Elektroda złota jest pokryta merkaptoetanolem i hinolem, a następnie funkcjonalizowana poprzez dodanie rozcieńczonych sond wychwytujących.

Hybrydyzacja typu „sandwich” docelowego rybosomalnego RNA z sondą wychwytującą oraz znakowaną fluoresceiną sondą detekcyjną prowadzi do powstania kompleksu, który jest wykrywany poprzez dodanie koniugatu peroksydazy chrzanowej przeciw fluoresceinie oraz substratu TMB. Prąd parametryczny M jest generowany przez cykl redoks wynikający z utleniania TMB przez peroksydazę chrzanową oraz redukcji TMB przez elektrony z elektrody. Przedstawione tutaj analizy wykorzystują matrycę czujników Gene Fluidic 16.

Każdy z czujników w macierzy zawiera trzy elektrody: roboczą, odniesienia i pomocniczą, które posiadają punkty kontaktowe na krawędzi chipa. Czytnik chipa posiada piny pogo, które łączą się z każdym z punktów kontaktowych. Czytnik chipa służy jako interfejs dla macierzy czujników z potencjometrem sterowanym przez algorytm komputerowy.

Poniżej przedstawiono przykłady przepływu prądu w czujniku elektrochemicznym. Przepływ prądu w czujnikach jest sztucznie wysoki podczas pierwszych kilku sekund po rozpoczęciu pomiarów parametrycznych. Ze względu na akumulację utlenionego substratu w czasie od aplikacji TMB na powierzchnię czujnika do uruchomienia algorytmu odczytu, przepływ prądu szybko osiąga stan stacjonarny, a dokładne odczyty z czujnika można niezawodnie uzyskać w ciągu 60 sekund.

Zmienność między sensorami jest stosunkowo stała, dzięki czemu możliwe jest równoległe przeprowadzenie 16 różnych analiz sensorycznych na macierzy 16 sensorów Gene Fluidic. Niezbędne jest zastosowanie kontroli dodatniej i ujemnej. W tym celu wykorzystuje się syntetyczny mostkowy oligonukleotyd DNA, który hybrydyzuje zarówno z sondą wychwytującą, jak i detekcyjną, służąc jako syntetyczny cel o znanym stężeniu. Wyniki uzyskane przy użyciu oligonukleotydu mostkowego pełnią funkcję wewnętrznej kontroli kalibracyjnej, aby zminimalizować różnice między poszczególnymi chipami.

Im większy ujemny prąd elektrody, tym wyższy sygnał. Podczas testowania sond przechwytujących i detekcyjnych granica wykrywalności powinna być określona poprzez seryjne rozcieńczanie próbki o znanym stężeniu; jak pokazano na tej ilustracji, w zakresie dynamicznym analizy występuje liniowa korelacja log-log między stężeniem próbki a sygnałem wyjściowym.

Na tych wykresach słupkowych przedstawiono reprezentatywne wyniki dla próbek zawierających Escherichia coli, Klebsiella spp. oraz amoniak, które często występują w moczu pacjentów z zakażeniami dróg moczowych. Sygnały dla większości czujników będą niskie i zbliżone, a te negatywne wyniki można połączyć jako sygnał tła. Reaktywność z parą sond KE odróżnia Klebsiella od Escherichia coli. Oligonukleotyd mostkujący służy jako kontrola pozytywna i wewnętrzny standard kalibracyjny. Technikę tę można zastosować do wykrywania bakterii opornych na antybiotyki w próbkach klinicznych poprzez pomiar odpowiedzi fenotypowej bakterii na antybiotyki.

Technikę tę można wykorzystać do wyznaczenia optymalnej terapii dla poszczególnych pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykrywania i identyfikacji bakterii poprzez porównywanie prądów w różnych czujnikach specyficznych dla gatunków w chipie.