Analiza kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków za pomocą mikroiniekcji

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar kinetyki eksportu mRNA z jądra komórkowego w komórkach ssaków. Osiąga się to poprzez mikroiniekcję mRNA lub DNA do jąder komórek hodowlanych tkanek ssaków. Po mikroiniekcji próbki są utrwalane po różnych okresach inkubacji.

Następnie mRNA poddaje się barwieniu metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Ostatnim etapem procedury jest obrazowanie komórek oraz ilościowe określenie poziomu fluorescencji w cytoplazmie i jądrze. W rezultacie tempo eksportu mRNA można zmierzyć, łącząc metodę mikroiniekcji z mikroskopią fluorescencyjną.

Cześć, jestem SRG AV z laboratorium Alexa Palazzo w Katedrze Biochemii na Uniwersytecie w Toronto. Jestem Stefan Toski, również z laboratorium Palazzo. Jestem Amy z laboratorium Palazzo, a ja jestem Khi Maha David z laboratorium Palazzo.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wprowadzania mRNA do jąder komórek hodowli tkankowych ssaków za pomocą mikroiniekcji. Przedemonstrujemy również sposób barwienia mRNA metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Stosujemy te procedury w naszym laboratorium w celu badania kinetyki nuklearnego eksportu mRNA w komórkach ssaków.

Zacznijmy zatem. Przed mikroiniekcją należy rozpuścić wcześniej przygotowane plazmidowe DNA w buforze do iniekcji do stężenia od 50 do 200 µg/mL. Następnie do mieszaniny należy dodać Oregon Green 488 (OG) sprzężony z dekstraną o masie 70 kDa, aby umożliwić identyfikację wstrzykniętych komórek.

Skoniugowany dekstran OG pomoże określić, jaka ilość płynu została wstrzyknięta do jądra komórkowego, a jaka przedostała się do cytoplazmy. Próbki należy wirować przy 13 000 G i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 20 minut, aby odwirować wszelkie cząsteczki, które mogłyby potencjalnie zablokować końcówkę igły. Wybierz linię komórkową ssaków do mikroiniekcji w oparciu o kryteria opisane w pisemnym protokole kosztowym.

Do tej demonstracji wykorzystano siedem komórek. Komórki umieszczono na zakwaszonych i wypłukanych szkiełkach nakrywkowych w 30 milimetrowych szalkach Petri co najmniej 24 godziny przed mikroiniekcją. Idealnie, w momencie iniekcji warstwa komórek powinna być w stopniu zlewania się (konfluencji) około 70 do 90%, aby umożliwić łatwą identyfikację iniektowanych komórek; przed iniekcją w warstwie komórkowej wykonuje się nacięcie za pomocą plastikowego końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Wytraw nacięcie w kształcie krzyża na szkiełku nakrywce i pozostaw komórki do regeneracji w inkubatorze do hodowli tkanek przez co najmniej 15 minut przed wstrzyknięciem. Do mikrowstrzykiwania należy użyć mikroskopu odwróconego, który jest odizolowany na stole pneumatycznym, aby zminimalizować wibracje mogące zakłócić proces mikrowstrzykiwania. Używając końcówki do nakładania żelu einor, usuń około 1 µL z górnej części próbki w wirówce, aby uniknąć rozbicia osadu.

Wprowadź końcówkę pipety do tylnej części gotowej igły do mikroiniekcji i wydrukuj ciecz. Ciecz zostanie wciągnięta do końcówki igły dzięki działaniu kapilarnemu. W ciągu od 5 do 30 sekund powinien pojawić się widoczny menisk w pobliżu końcówki.

Wprowadź wypełnioną cieczą igłę do uchwytu i przymocuj go do mikromanipulatora. Pod kątem 45 stopni zlokalizuj igłę przy użyciu obiektywu 10x i ustaw ją w centrum pola widzenia w pobliżu płaszczyzny ogniskowej. Za pomocą pokręteł grubego nastawiania mikromanipulatora należy przeprowadzić pozycjonowanie; uchwyt jest połączony rurką ze szklaną strzykawką, która służy do wytworzenia ciśnienia wymaganego do wypchnięcia cieczy z końcówki igły.

Aby utrzymać stałe ciśnienie, strzykawkę montuje się w zacisku rurkowym. Używając dwóch gumowych korków i dwóch metalowych zacisków, należy podnieść igłę o kilka milimetrów, aby zapobiec jej uszkodzeniu w późniejszych etapach, a następnie odsunąć mikroskop. Zwiększ ciśnienie, naciskając tłok strzykawki.

od 0,5 do dwóch centymetrów sześciennych. Umieść szalkę Petriego zawierającą szkiełko nakrywowe z uszkodzoną monowarstwą. Na stole obiektowym odsuń mikroskop.

Przesuń filar do przodu do pozycji pionowej, tak aby kondensator został wyrównany, umożliwiając igle wniknięcie do cieczy. Należy to zrobić ostrożnie, aby zapobiec złamaniu igły o szkiełko nakrywki. Używając obiektywu 10x, zidentyfikuj środek przecięcia linii i ustaw igłę nad komórkami, które mają zostać zainfekowane.

Zwiększ powiększenie, przełączając obiektyw na 40 x. Następnie opuść i wycentruj igłę, korzystając z pokręteł mikrometrycznych w dżojstiku. Rozpocznij iniekcję w jednym z narożników krzyżyka rany, opuszczając igłę tak, aby zetknęła się z jądrem.

Po wstrzyknięciu w komórce następuje wyraźna zmiana jasności w kontraście fazowym. Kontynuuj wzdłuż jednej krawędzi krzyża rany. Aby umożliwić łatwą identyfikację wstrzykniętych komórek podczas wizualizacji, kluczowe jest odpowiednie dostosowanie ciśnienia wtrysku dla każdej igły.

Ciśnienie musi być wystarczająco wysokie, aby przebić błony plazmatyczne i jądrowe, ale nie na tyle duże, by zabić komórki. Przeprowadź mikroiniekcje komórek wzdłuż krawędzi rany przez określony czas. Dzięki wprawie w tym przedziale czasowym można ziniekować kilkaset komórek.

W przypadku wstrzykiwania plazmidowego DNA należy inkubować komórki po mikroiniekcji w temperaturze 37°C w inkubatorze do hodowli tkanek przez 20 minut przed fiksacją, a następnie przerwać transkrypcję. Należy to zrobić poprzez potraktowanie komórek roztworem 1 µg/mL α-amanityny rozpuszczonej w pożywce wzrostowej. Takie stężenie skutecznie hamuje transkrypcję z mikroiniekcyjnych plazmidów.

Umieść komórki z powrotem w inkubatorze i pozwól im na eksport nowo zsyntetyzowanego mRNA. Pojedyncza igła może być użyta wielokrotnie do wstrzyknięcia materiału do wielu szkiełek nakrywkowych. Igłę należy jednak wymienić, gdy zmieni się rodzaj mikroiniekcyjnego DNA lub RNA.

Ponadto, po wyjęciu igły z urządzenia, należy ją zutylizować, aby uzyskać dokładny pomiar kinetyki eksportu mRNA z jądra. Oddzielne próbki należy utrwalić w zero minut, 15 minut, 30 minut, 60 minut i 120 minut. Po zakończeniu inkubacji z alpha manin w odpowiednim czasie, należy odessać pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przemyć komórki dwiema mililitrami roztworu PBS.

Ważne jest, aby utrzymać szkiełka nakrywkowe w stanie wilgotnym, minimalizując czas, w którym nie są one zanurzone w cieczy. Utwierdź komórki, dodając 2 mL 4% aldehydu w PBS, i inkubuj je przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej. Po ponownym dwukrotnym przemyciu utwierdzonych próbek, przeprowadź permeabilizację komórek za pomocą 2 mL 0,1% Triton X 100 w PBS, inkubując je ponownie przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej.

Na koniec przemyj próbki dodatkowe dwa razy, aby przygotować je do hybrydyzacji. Komórki przemyj dwukrotnie buforem płuczącym w postaci rozwiązania 1XSSC zawierającego od 25 do 60% formamidu. Następnie przygotuj komorę barwienia do hybrydyzacji, pokrywając dno 150 milimetrowej płytki Petri wodą i kładąc na jej powierzchni kawałek parafiny.

Usuń wodę, odwracając naczynie, aby paraformułaza przywarła do jego dna. Ręcznie usuń pęcherzyki powietrza z każdego szkiełka nakrywkowego przeznaczonego do barwienia. Nanieś pipetą krople 100 µL roztworu do hybrydyzacji na paraformułazę.

Należy pamiętać, że ilość formage powinna zostać zoptymalizowana dla konkretnego używanego białka rybiego przy pomocy pęsety. Usunąć szkiełko nakrywkowe z utrwalonymi komórkami z 30 milimetrowej szalki Petriego. Używając papieru filtracyjnego Watman, osuszyć tylną stronę szkiełka nakrywkowego i odsączyć nadmiar buforu z przedniej strony, uważając, aby nie wysuszyć komórek.

Następnie należy położyć szkiełko nakrywkę stroną roboczą do dołu na roztwór z rybą. Powtórz tę procedurę dla każdego szkiełka nakrywki. Po ponownym założeniu pokrywy komór barwiących inkubuj próbki przez okres od 5 do 18 godzin w temperaturze 37 °C.

Przygotuj kilka komór płukania w ten sam sposób, w jaki przygotowano komorę barwienia. Do każdej z nich nanieś pipetą 1 mL buforu do płukania na parafórmę komory płukania. Po inkubacji przenieś szkiełka nakrywki z komory barwienia, dodając 1 mL buforu do płukania. Płyn powinien zostać wciągnięty pod każdą próbkę przez działanie kapilarne obok szkiełka nakrywki.

Następnie za pomocą pęsety należy zdjąć szkiełka nakrywkowe i umieścić każde z nich w kropli buforu do mycia inkubowanego w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Każde szkiełko nakrywkowe należy przemyć jeszcze dwukrotnie, tak aby łącznie wykonać trzy mycia dla każdego szkiełka. Za pomocą pipety nanieść od 10 do 30 µL medium montażowego z DAPI na uprzednio umyte szkiełko podstawne. Na każdym szkiełku podstawnym można umieścić dwa szkiełka nakrywkowe, używając pęsety oraz papieru filtracyjnego Whatman.

Osusz spód szkiełek nakrywkowych i usuń nadmiar cieczy z ich górnej strony, nie wysuszając próbek. Połóż każde szkiełko nakrywkowe stroną skierowaną w dół na kroplę medium montażowego. Zamontowane próbki można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsius.

Tutaj przedstawiono efekty działania alfa-mantyny na transkrypcję wstrzykniętego plazmidowego DNA w komórkach fibroblastów NIH 3T3, które poddano wstępnej obróbce różnymi stężeniami alfa-mantyny. Wstrzyknięto do nich plazmidowe DNA TFL s delta i oraz koniugowany OG 70 kDa dekstran. Każdy wiersz odpowiada pojedynczemu polu widzenia obrazowanemu pod kątem OG 70 kDa dekstranu oraz mRNA T uts delta I.

Wyraźnie widać, że wysokie stężenia leku całkowicie zahamowały produkcję transkryptu T UTS delta I, podczas gdy w przypadku niższych stężenia nie zaobserwowano takiego efektu. Przedstawiono przebieg czasowy kosztu eksportu mRNA z jądra. Siedem komórek wstrzyknięto z plazmidowym DNA T UTS delta i oraz koniugowanym z OG dekstranem 70 kilodalton.

30 minut po iniekcji komórki traktowano alpha mantiną i inkubowano w temperaturze 37°C przez 0 minut, 60 minut oraz 120 minut. Następnie komórki utrwalono i zabarwiono sondą przeciwko mRNA T UTS delta I oraz przeciwciałami przeciwko markerowi ER trap alpha; każdy wiersz odpowiada pojedynczemu polu widzenia komórek.

Informacje na temat sposobu ilościowego oznaczania eksportu mRNA znajdują się w tekście dostępnym online pod tym linkiem. Punkt czasowy 120 minut został powiększony. Aby zademonstrować kolokalizację mRNA TFS delta I w ER, przedstawiono nałożenie obrazu mRNA T UTS delta I w kolorze zielonym oraz trap alpha w kolorze czerwonym. Informacje na temat sposobu barwienia mRNA wraz z białkami można znaleźć w tekście dostępnym online.

Właśnie pokazaliśmy, jak mierzyć kinetykę eksportu jądrowego mRNA za pomocą mikroiniekcji. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że skuteczna mikroiniekcja wymaga odpowiedniego przygotowania. Kluczowe kroki, takie jak przygotowanie próbek DNA i RNA, wyciąganie igieł, ustawianie sprzętu optycznego oraz rozwiązywanie problemów z mikroiniekcją, opisane są w naszym protokole pisemnym.

Podczas obrazowania i analizy mikroiniekcji mRNA ważne jest, aby kwantyfikacja ograniczała się do komórek, do których jądra trafiło ponad 90% wstrzykniętego płynu. Prawidłową iniekcję do jądra można ocenić, wizualizując rozkład organ green dextranu w jądrze i cytoplazmie. Więcej informacji na temat projektowania sond dla ryb oraz korzystania z oprogramowania do analizy obrazu w celu badania rozkładu mRNA w cytoplazmie i jądrze można znaleźć w naszym protokole online.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.