Test klonogenny: komórki adherentne

Cześć, nazywam się Lum i obecnie przygotowuję doktorat w BE IDI Heart and Diabetes Institute pod kierunkiem dr Tom Carianne, która kieruje Epigenomic Medicine Lab. W tym filmie zaprezentuję procedurę znaną jako Clon Genic Survival Assay. Jest to technika opracowana 50 lat temu, która umożliwia ocenę wpływu różnych działań, takich jak ekspozycja na promieniowanie lub czynniki chemiczne, na zdolność komórek do reprodukcji.

Test przeżywalności kogenicznej jest kluczową techniką w radiobiologii, służącą do oceny wrażliwości radiacyjnej różnych linii komórkowych oraz testowania skuteczności różnych związków radioprotekcyjnych lub radiosensybilizujących. W przypadku użycia adhezyjnej linii komórkowej, test przeżywalności kriogenicznej składa się z trzech etapów. Pierwszym z nich jest potraktowanie monowarstwy komórek adhezyjnych.

Po drugie, przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek oraz wysiew znanej liczby komórek na szalki, a po trzecie, barwienie, liczenie i ocena kolonii utworzonych po okresie inkubacji. W tym filmie wykorzystam unieśmiertelnione ludzkie komórki cynocytów, aby zademonstrować, w jaki sposób test poligeniczny może być użyty do określenia właściwości radioprotekcyjnych naturalnego przeciwutleniacza. Wcześniej w kolbach T25 wysiano komórki w 5 mL pożywki, tak aby w dniu eksperymentu w każdej kolbie znajdowało się 1 milion komórek.

Do pięciu ml pożywki w każdej odpowiednio oznakowanej kolbie dodaje się 50 µL leku w różnych stężeniach, aby uzyskać wymagane stężenie; w tym przypadku stosuje się pięć stężeń oraz jedną kontrolę nośnika, którą jest PBS. Po dodaniu leku komórki inkubuje się przez jedną godzinę w warunkach odpowiednich dla zastosowanej linii komórkowej. Po inkubacji próbki, z wyłączeniem grupy kontrolnej, naświetla się wybraną dawką, która w tym przypadku wynosi 4 Gy, generowaną przez źródło cezu emitujące promieniowanie gamma.

Po napromieniowaniu odlane zostają pożywki, a każdą kolbę przemywa się 2 ml PBS przez pięć minut. Po odlaniu PBS do każdej kolby dodaje się 2 ml 0,05% trypsyny, aby odspoić przylegające komórki A od ścianek kolby. Następnie do każdej kolby dodaje się 5 ml DMEM zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej w celu dezaktywacji trypsyny.

Pełna zawartość frakcji zostaje następnie przeniesiona do oznakowanych probówek typu Falcon o pojemności 10 ml. Po zakończeniu tej czynności probówki są wirowane przez pięć minut, po czym supernatant jest ostrożnie odrzucany, tak aby nie naruszyć osadu, a do każdej probówki dodaje się 5 ml pożywki Crecy. Następnie obliczana jest koncentracja komórek dla każdej próbki, a także objętość każdej próbki niezbędna do uzyskania końcowej koncentracji komórek, które zostaną wysiane na pięć szalek Petri na próbkę, z 5 ml pożywki na każdą z nich.

Na przykład w przypadku grupy kontrolnej na każdą płytkę wysiewa się 100 komórek, zatem objętość potrzebna do uzyskania 500 komórek na 25 mililitrów jest obliczana; dla bardziej skoncentrowanych próbek należy wykonać rozcieńczenie 10-krotne lub seryjne rozcieńczenie 100-krotne, aby zminimalizować błąd przy użyciu objętości mniejszych niż 100 mikrolitrów. Następnie uprzednio obliczona objętość jest przygotowywana w probówce Falcon zawierającej 25 mililitrów pożywki dla każdej próbki. Próbki można teraz przenieść do uprzednio oznakowanych płytek, dodając po pięć mililitrów do każdej z nich w celu łatwiejszej manipulacji i transportu.

Przechowywać szalki w dużym, sterylnym lub zdezynfekowanym pojemniku. Następnie szalki umieszcza się w inkubatorze z nawilżaczem w odpowiednich warunkach i inkubuje przez osiem dni. W przypadku wykorzystania keratynocytów po ośmiu dniach należy ostrożnie wyjąć szalki z inkubatora i rozłożyć je pojedynczo wewnątrz dygestorium.

Należy ostrożnie obchodzić się z płytką, aby nie naruszyć powstałych kolonii. Zdjąć pokrywki i dodać 5 ml 0,9% soli fizjologicznej do każdej płytki w celu ich przemycia. Nakierować przygotowany grot pipety w róg płytki, unikając dotykania jej dna, aby nie zeskrobać przypadkowo kolonii.

Po pięciu minutach ostrożnie odessać sól fizjologiczną. Następnie kolonie utrwala się za pomocą trzech mililitrów 4% roztworu, a pokrywki należy założyć z powrotem, aby zapobiec odparowaniu. Po od 15 minut do pół godziny roztwór jest odsysany i utylizowany w odpowiedni sposób.

Kolonie są teraz gotowe do barwienia 0,1% fioletem krystalicznym; do każdej szalki dodaje się pięć mililitrów barwnika i po pół godziny do jednej godziny zakłada się pokrywki. Następnie barwnik jest wypłukiwany wodą destylowaną, a szalki zostają odwrócone i pozostawione do wyschnięcia na noc. Kolonie są teraz gotowe do przeliczenia.

Kolonie można policzyć ręcznie przy użyciu mikroskopu stereoskopowego. Każdy skup komórek zawierający 50 lub więcej komórek jest uznawany za kolonię. To kończy naszą prezentację testu przeżywalności kongenicznej.

Główną zaletą tego testu w porównaniu z innymi technikami jest jego niezwykła czułość, która pozwala na wykrycie przeżywalności w szerokim zakresie, nawet po sześciokrotnym logarytmicznym spadku liczby komórek. Czułość ta jest osiągana dzięki wysiewaniu większej liczby komórek. Test ten można z łatwością wykorzystać w innych celach, na przykład do badania cytotoksyczności.

Dziękujemy za obejrzenie.