Projektowanie biologicznych przeszczepów naczyniowych z wykorzystaniem bioreaktora pulsacyjnego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie biologicznych przeszczepów naczyniowych z wykorzystaniem pulsacyjnego systemu bioreaktora. Jest to realizowane poprzez przygotowanie biodegradowalnego rusztowania z siatki PGA, na której będą rozwijać się komórki, a następnie zamieszczenie go w komorze bioreaktora. Rusztowania są następnie zasiedlane komórkami mięśni gładkich, a komora bioreaktora zostaje zamknięta pokrywą z uszczelnionymi rurkami doprowadzającymi powietrze i pożywkę.

Następnie bioreaktor zostaje podłączony do systemu przepływowego, aby zapewnić pulsacyjny przepływ do naczyń w bioreaktorze. W reaktorze komórki rozwijają się w naczynia, które przechodzą testy immunochemiczne, biochemiczne i mechaniczne. Znaczenie tej techniki rozciąga się na terapię choroby wieńcowej, ponieważ metoda ta stanowi obiecujące podejście do regeneracji implantowalnych przeszczepów naczyniowych o małej średnicy do pomostowania tętniczego.

Choć metoda ta pozwala na uzyskanie wiedzy w zakresie inżynierii naczyniowej, można ją zastosować do innych układów narządowych poddawanych cyklicznym siłom fizjologicznym. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności. Pełne opanowanie tych umiejętności wymaga wprawy i częstej praktyki.

Pomysł na to podejście pojawił się, gdy uświadomiliśmy sobie znaczenie zastosowania fizjologicznej stymulacji mechanicznej w celu regeneracji konstruktów inżynieryjnych. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ procesy bioreaktorowe są trudne do opanowania ze względu na liczne etapy i mogą zostać przyswojone jedynie poprzez szczegółowy pokaz. Na początek należy użyć wody destylowanej do oczyszczenia 30 centimeter odcinków rurek silikonowych o średnicy wewnętrznej trzech milimetrów, a następnie pozostawić je do wyschnięcia na powietrzu.

Za pomocą nożyczek wytnij fragment siatki PGA o wymiarach 1,1 cm na 8 cm dla każdego odcinka rurki. Przy użyciu kleszczyków hemostatycznych przymocuj siatkę PGA do rurki, wiążąc trzy węzły chirurgiczne nicią Dexon 6.0, a następnie wykonaj pojedyncze szwy kleszczykami hemostatycznymi; tak zabezpieczona siatka tworzy rusztowanie PGA. Przemyj rusztowania, najpierw zanurzając je w 1 M wodorotlenku sodu na 1-2 minuty, a następnie trzykrotnie zanurzając w wodzie destylowanej po 2 minuty na każde zanurzenie. Osusz je delikatnie między kolejnymi płukaniami, a po trzecim płukaniu pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w dygestorium przez 15 minut.

Po wysuszeniu zaszyj jednocentymetrowe mankiety z Dacronu na obu końcach siatki, wykonując trzy szwy. Pozostaw od dwóch do trzech milimetrów zakładki rurki i nie przebijaj rurki. Należy pozostawić około 15 cm wolnej nici chirurgicznej do późniejszego wykorzystania w tym protokole.

Wszystkie komponenty i narzędzia bioreaktora należy wcześniej poddać autoklawowaniu. Na dzień przed rozpoczęciem hodowli w bioreaktorze, urządzenie musi zostać częściowo złożone; należy zanurzyć komponenty bioreaktora – rusztowania, siatkę, rurki silikonowe, narzędzia chirurgiczne oraz cienki drut dłuższy niż długość bioreaktora – w 70% etanolu na co najmniej 30 minut. Za pomocą drutu należy przeciągnąć rurki silikonowe przez boczne wyloty reaktora.

Teraz wyjmij bioreaktor i zamocuj wewnątrz rusztowania PGA, mocując mankiety z Dacronu na rozszerzonych krawędziach szklanych. Wykorzystaj nadmiar nici chirurgicznej, aby zawiązać każdy mankiet. Następnie, używając łączników, podłącz rurki silikonowe po jednej stronie rusztowania do jednej pary ramion bioreaktora, a rurki po drugiej stronie rusztowania do dwóch pozostałych ramion.

Po zainstalowaniu łączników wyciągnij je z bocznych ramion i przepłucz bioreaktor etanolem. Pozostaw reaktor do namaczania przez 10 minut z każdej strony. Umieść bioreaktor na szalkach Petriego i przepłucz go pożywką do hodowli tkanek.

Przepłucz wodą. Używając pipety, upewnij się, że wypłukałeś również siatkę i rurki. Następnie umieść sterylną mieszadłkę magnetyczną w reaktorze do późniejszego użycia i susz aparat przez noc w dygestorium z włączonym nawiewem i wyłączonym promiennikiem UV od tego momentu.

Nie należy pochylać się nad reaktorem, ponieważ może to doprowadzić do kontaminacji. Podczas przygotowania wszystkie złącza muszą zostać przetarte alkoholem. Przed wykonaniem połączeń wiele złączy należy wzmocnić paraformą, którą przed nałożeniem trzeba namoczyć w 70% etanolu. Należy zatem przygotować odpowiednią ilość obu tych substancji.

W ramach środków ostrożności należy umieścić sterylną szalkę Petriego nad każdym otworem bioreaktora, aby chronić znajdujące się wewnątrz rusztowanie PGA przed zanieczyszczeniami. Następnie należy rozpocząć konfigurację, mocując port wtryskowy do trzeciego wolnego ramienia bioreaktora. W kolejnym kroku należy połączyć worek IV z systemem przepływowym.

W zestawie drenów walrus zawiąż niebieski koniec jak najbliżej rozwidlenia w kształcie litery Y i zaciśnij rurkę zaciskiem. Podłącz czerwoną rurkę do dalszego końca worka z płynem infuzyjnym. Następnie podłącz białą rurkę do jednej strony układu przepływowego.

Wstaw trójdrożny kranik w systemie przepływowym. Jeden koniec rurki przetwornika ciśnienia podłącz do kranika, a drugi koniec do środniego otworu worka do infuzji. Następnie, aby częściowo wypełnić system przepływowy i sprawdzić szczelność, dodaj do worka do infuzji 350 milliliters PBS oraz 1% fungi zone.

Używając strzykawki o pojemności 60 mililitrów przed lub po podłączeniu do systemu przepływowego, należy ustawić kurek, aby kontrolować kierunek przepływu PBS, a następnie ścisnąć worek, aby przepłukać system. Ten krok można wykonać zarówno przed, jak i po osadzaniu komórek. Teraz komórki mogą zostać osadzone w bioreaktorze.

W tym przykładzie resuspenduj 8 milionów komórek SM (co odpowiada około jednej konfluencyjnej hodowli w naczyniu T 75) w 1,25 mililitrach pożywki, a następnie nanieś je równomiernie kroplowo na rusztowanie PGA, od złącza Dacron do złącza Dacron. Po dodaniu komórek przetrzyj krawędź bioreaktora alkoholem. Unikaj pochylania się bezpośrednio nad reaktorem.

Następnie ostrożnie złóż pokrywę z silikonowym korkiem. Należy uważać, aby nie odsłonić spodu pokrywy podczas wyjmowania jej z worka do autoklawu oraz w trakcie wszystkich kolejnych etapów montażu. Najpierw przymocuj port wstrzykiwania do rurki zasilającej w miejscu złącza męskiego.

Po drugie, do każdego z trzech portów dostępowych przymocuj filtry PTFE 0,20 mikrona. Po trzecie, zabezpiecz port wtryskowy folią. Włóż zmontowaną pokrywę z silikonowym korkiem do szklanego bioreaktora.

Upewnij się, że rurka doprowadzająca pożywkę nie dotyka osadzonych rusztowań PGA. Następnie uszczelnij całość parafilmem. Teraz podłącz bioreaktor do układu przepływowego, a następnie umieść bioreaktor wraz z układem przepływowym w inkubatorze w temperaturze 37 °C.

Przez 25 do 30 minut reaktor należy ustawić na boku i obracać co pięć minut. Następnie, wciąż w inkubatorze, należy napełnić komorę bioreaktora 400 mililitrami pożywki hodowlanej four to 10 za pomocą pompy przez rurkę doprowadzającą. Teraz należy inkubować zasiane rusztowania bez pulsacyjnego pompowania przez sześć do siedmiu dni w temperaturze 37 °C przy 5% carbon dioxide.

W tym czasie nie ma potrzeby wymiany pożywki ani suplementacji witaminą C; przed włączeniem pompy należy sprawdzić, czy przewody nie są nieszczelne lub załamane. Następnie należy dostosować prędkość pompy tak, aby utrzymać zakres ciśnienia od -30 do 270 mmHg. Ciśnienie to należy monitorować i utrzymywać codziennie przez cały okres hodowli.

Wymianę pożywki oraz suplementację kwasem askorbinowym należy przeprowadzać dwa razy w tygodniu podczas wzrostu rusztowania z zastosowaniem pompowania pulsacyjnego w celu podania świeżej pożywki; najpierw należy zamocować port wtryskowy i filtr PTFE na pokrywach doprowadzających, służących zarówno do wymiany pożywki, jak i do usuwania zużytej pożywki. Następnie należy mocno umieścić rurkę doprowadzającą w pompie dwukierunkowej, wkładając jeden koniec do portu doprowadzającego bioreaktora, a drugi koniec do pokrywy doprowadzającej. Teraz należy powoli rozpocząć wypompowywanie 200 mililitrów pożywki.

Prędkość pompy można stopniowo zwiększać. Następnie należy podłączyć nową rurkę doprowadzającą i powoli rozpocząć pompowanie 200 milliliters świeżej pożywki. Aby dodać kwas askorbinowy do reaktora, należy odessać 25 milliliters pożywki za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 30 milliliters.

Dodaj pięć mililitrów sterylnego roztworu kwasu askorbinowego, a następnie odzyskaj 25 mililitrów. Inżynieryjne naczynia w medium będą wydawać się nieprzezroczyste i osiągną grubość ścianki około 250 mikronów po ośmiotygodniowej hodowli. W warunkach pulsacyjnych barwienie hematoksyliną, eozyną i kwasem pruskim inżynieryjnych naczyń wykazuje zmiany morfologii tkanki w czasie oraz w zależności od pulsacji.

Strona luminalna naczyń jest oznaczona literą L przy barwieniu trójskładnikowym Massona. Barwienie na kolagen wykazuje, że naczynia poddawane impulsom przez cztery tygodnie mają więcej kolagenu niż ich odpowiedniki niepoddawane impulsom; białe strzałki wskazują pozostałe fragmenty PGA w naczyniach w 12. tygodniu. Analiza immunochemiczna wykazuje ekspresję wczesnego markera mięśni gładkich aktyny alfa, pośredniego markera mięśni gładkich kalponiny 1 oraz późnego markera mięśni gładkich ciężkiego łańcucha miozyny. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać przeprowadzona w ciągu siedmiu do ośmiu godzin.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu maksymalnej czystości i sterylności zgodnie z poniższym opisem. W celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak znaczenie modyfikacji powierzchni światła w utrzymaniu naczyń inżynieryjnych podczas badań in vivo, można zastosować inne metody, np. modyfikację światła naczyń inżynieryjnych, po ich opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny inżynierii tkankowej, a w szczególności inżynierii naczyniowej, do poszukiwania potencjalnych metod leczenia chorób tętnic wieńcowych w modelach zwierzęcych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak uzyskać implantowalne inżynieryjne przeszczepy naczyniowe poprzez dynamiczną kulturę powysiewną. Pamiętaj, że praca z wodorotlenkiem sodu może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak ochrona oczu i fartuch laboratoryjny.