Elastomeryczne rusztowania PGS w inżynierii tkanki tętniczej

Niniejszy film prezentuje sposób wytwarzania porowatych rusztowań rurkowatych oraz poddawania ich dynamicznemu warunkowaniu mechanicznemu w celu inżynierii tkanki tętniczej. Proces ten rozpoczyna się od wytworzenia rusztowań przy użyciu biodegradowalnego elastomeru i metody fuzji termicznej. Następnie rusztowania są przygotowywane do zasiewu komórek i montowane w systemie bioreaktora.

W bioreaktorze komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych zasiewają rusztowania, a następnie są hodowane. Po kilku tygodniach tkanka jest pobierana i analizowana przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej, barwienia H&E oraz autofluorescencji elastyny. Powstały mięsień gładki jest wielowarstwowy i zorientowany prostopadle.

Główną zaletą tej techniki, podobnie jak w przypadku odbarwiania cząsteczkowego, jest wykorzystanie szklanej formy do wytwarzania porowatego rusztowania rurkowego z kwasu hialuronowego. Po usunięciu formy, rusztowanie zostaje przygotowane z odcinka rurki szklanej. Umieść rurkę w uchwycie i wlej do niej przygotowany dzień wcześniej roztwór kwasu hialuronowego.

Kwas hialuronowy powoli spływa po wewnętrznej ściance. Gdy dotrze on do dna formy, należy obrócić formę. Powtarzaj ten krok, aż wewnętrzna ścianka formy zostanie równomiernie pokryta roztworem.

Po nałożeniu powłoki wysuszyć wszystkie przygotowane formy szklane w suszarce próżniowej w temperaturze 37°C przez 24 godziny. Zazwyczaj przygotowuje się cztery formy jednocześnie podczas suszenia form szklanych. Przygotować porcje cząstek soli, mieląc i przesiewając cząstki soli do rozmiaru od 25 do 32 µm.

Następnego dnia zmontuj przygotowany trzpień szklanej formy, rurkę PTFE, rurkę termokurczliwą oraz pierścień PTFE. Najpierw włóż trzpień do 65 milimetrowych odcinków rurki PTFE i wypiecz je w temperaturze 120 °C przez pięć minut. Aby obkurczyć PTFE, w czasie oczekiwania wstępnie podgrzej inkubator do hybrydyzacji do 37 °C przez co najmniej 30 minut.

Po opasaniu trzpieni rurką, nasuń rurkę termokurczliwą na trzpień tak, aby poruszała się swobodnie. Następnie umieść trzpień w szklanej formie i przymocuj pierścień A-P-T-F-E do dolnej części trzpienia. Sprawdź, czy pierścień PTFE ściśle przylega do dna szklanej formy.

Następnie, używając szpatułki i lejka z gumy silikonowej, należy wprowadzić zawiesinę cząsteczek soli do szklanej formy. Następnie delikatnie opukać formę szpatułką w celu równomiernego rozłożenia cząsteczek i zebrać nadmiar soli. Teraz należy wyłączyć podgrzewany inkubator i szybko włożyć do niego wypełnione solą formy; sól spoi się w ciągu kolejnych 30 minut, po czym formy należy suszyć w piecu próżniowym w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.

Następnego dnia, po schłodzeniu, wyjmij stalowy trzpień z form, wypychając go przy jednoczesnym przytrzymaniu pierścienia z PTFE. W razie potrzeby użyj szczypiec półokrągłych. Następnie zdejmij pierścień z PTFE z dna formy.

Następnie wypiecz formy, aby obkurczyć tulejkę, a następnie wyjmij obkurczone tulejki z form. Pozostaw formy do ostygnięcia przed kolejnym użyciem i przechowuj je w eksyكاته w dygestorium. Używając pipety, przechyl szklane formy pod kątem 45 stopni i wlewaj roztwór PGS do ich wewnętrznego światła, powoli obracając formę.

Sprawdzić, czy roztwór PGS spływa po ściance formy. W przypadku wystąpienia suchych miejsc należy dodać więcej PGS. Następnie pozwolić THF odparować w dygestorium przez co najmniej 30 minut. Po całkowitym odparowaniu THF formy należy utwardzić w piecu próżniowym.

Po jednodniowym utwardzaniu schłodzić formy do temperatury pokojowej, a następnie powoli, w pionie, zanurzyć je w wodzie dejonizowanej o temperaturze 24°C. Zbyt szybkie pochylanie form powoduje powstawanie pęcherzyków powietrza, które rozrywają rusztowanie. Ostrożnie przenieść formy do łaźni wodnej.

Ustaw je pod kątem, używając rurki silikonowej, i pozostaw kwas hialuronowy do rozpuszczenia przez godzinę. Jeśli po godzinie kwas hialuronowy nie oddzielił się od formy, to przy zachowaniu zanurzenia formy należy za pomocą szpatułki powoli wypchnąć kwas hialuronowy z obu końców, a następnie powoli potrząsnąć formą. Następnie należy sprawdzić, czy rusztowania nie przesunęły się wewnątrz szklanej formy; jeśli tak, należy powoli wyciągnąć rusztowanie pęsetą, aby uwolnić je z formy.

Następnie wypłucz cząsteczki soli, ostrożnie przenosząc delikatne rusztowania do kąpieli z wodą dejonizowaną przy łagodnym mieszaniu. Proces ten potrwa co najmniej trzy dni i wymaga codziennej wymiany wody. Po całkowitym wypłukaniu soli przenieś każde rusztowanie do probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów wypełnionej wodą dejonizowaną i zamroź je w pojemniku z suchym lodem przez jedną godzinę. Umieść zamrożone probówki wirówkowe w liofilizatorze na trzy dni z otwartymi nakrętkami.

Po liofilizacji przechowywać rusztowania w eksykatorze do momentu ich użycia. Należy rozpocząć od pocięcia rusztowań na odcinki o długości od 25 do 30 milimetrów. Następnie przygotować dwa silikonowe korki, przekładając rurkę PTFE przez otwory środkowe każdego z korków.

Następnie odciąć odcinki pierścienia kurczliwego (HS) o długości 1,5 mm i nasunąć jeden z nich na jeden koniec rusztowania. Wsunąć rurkę PTFE przymocowaną do korka w ten sam koniec rusztowania, z zachowaniem wystarczającego nakładania się, aby znajdowała się pod pierścieniem HS, co zapewni trwałe połączenie rusztowania z rurką; skurczyć pierścień HS w piekarniku i pozwolić całemu zestawowi ostygnąć do temperatury pokojowej. Teraz na rusztowanie nasuwa się poliwęglanową rurkę o długości 50 mm, która pełni funkcję komory bioreaktora, a następnie mocuje ją na wewnętrznej powierzchni korka z gumy silikonowej.

Podobnie jak wcześniej, drugi wężyk PTFE i korek zostają zamocowane na drugim końcu rusztowania za pomocą pierścienia hs, aby domknąć komorę. Drugi korek zostaje przymocowany do drugiego końca rurki z poliwęglanu. Następnie zewnętrzne powierzchnie korków zostają przytwierdzone do dwóch płyt ze stopu aluminium.

Wprowadź dwie gwintowane pręty do otworu bocznego w każdej płytce i zabezpiecz płytki śrubami motylkowymi. Przymocuj rusztowanie do bioreaktora. Następnie zmierz widoczną długość każdego rusztowania, która jest odległością między dwoma pierścieniami hs, i oblicz ich wewnętrzne powierzchnie.

Do wysiewu komórek. W autoklawie wysterylizuj komory, z których każda powinna być indywidualnie zawinięta w folię, wraz z każdą częścią jednostki bioreaktora. Po sterylizacji zmontuj bioreaktor wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza.

Poddaj rusztowanie wstępnej obróbce i przemyj je za pomocą serii perfuzji, wykorzystując pompę perystaltyczną przy prędkości przepływu 1 mm/min w obiegu. Rozpocznij od płukania 70% etanolem, 50% etanolem, a następnie 25% etanolem przez jedną godzinę dla każdego roztworu. Po trzech płukaniach etanolem przeprowadź dwugodzinne płukanie w PBS.

Na koniec przeprowadź perfuzję bioreaktora pożywką do hodowli SMC przez 24 godziny, po czym będzie on gotowy do zasiewu komórek i prowadzenia eksperymentów. Następnie, zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym manuskrypcie, zasiej bioreaktor w zagęszczeniu 2 milionów komórek na centymetr kwadratowy, a przez kolejne 21 dni wymieniaj pożywkę w przewodach i koryguj prędkość pompy. Stopniowo ciśnienie w konstrukcie wzrośnie z około 4 mmHg w pierwszym dniu hodowli do ponad 100 mmHg po dwóch tygodniach hodowli; po trzech tygodniach hodowli zbierz komórki i przygotuj je do analizy zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie.

Te rurkowate rusztowania z PGS zostały wykonane metodą fuzji soli. Mikrografie z pomiarów skaningowego mikroskopu elektronowego wykazały, że wszystkie rusztowania posiadały jednorodną grubość ścianek i nie stwierdzono częściowych defektów w ich przekrojach poprzecznych. Na powierzchni luminalnej wszystkich rusztowań zaobserwowano losowo rozmieszczone makropory i mikropory.

Po hodowli komórkowej wielowarstwowe SMC rosły w orientacji prostopadłej do kierunku przepływu. Co więcej, komórki i białka DCM całkowicie pokryły światło wszystkich konstruktów PGS. Autofluorescencja elastyny wykazała również obwodowo zorganizowane włókna elastyczne na powierzchni luminalnej konstruktu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak przygotować porowaty rusztowanie rurkowe, zaobserwować komórki oraz hodować rusztowanie z wykorzystaniem specjalnie zaprojektowanego bioreaktora.