Urządzenie mikrofluidyczne z wzorami rowków do badania zachowania komórek

Nazywam się Jiang, jestem stypendystą przygotowującym poster na Harvardzie i w MIT w dziedzinie zdrowia, nauki i technologii. Moją specjalnością w tym laboratorium jest tworzenie nowatorskich urządzeń mikrofluidycznych do badania zachowań komórkowych. Potrafię projektować nowatorskie urządzenia do generowania gradientów, a także integrować je z moimi urządzeniami mikrofluidycznymi.

Urządzenie TC pozwala na precyzyjne manipulowanie interakcjami międzykomórkowymi, a także kontaktem komórek z czynnikami zewnętrznymi. Dzięki zastosowaniu systemu TC mogę badać i rozumieć podstawową biologię komórki, a także stosować wiedzę z zakresu biologii rozwoju oraz bioinżynierii komórek macierzystych. Nazywam się Amir Manchi i jestem studentem studiów licencjackich w laboratorium profesora Haana w Harvard, MIT Division of Health Sciences and Technology.

Pracuję nad urządzeniami mikrofluidycznymi i staramy się, w ramach dowodu koncepcji, wykazać, że urządzenia mikrofluidyczne mają ogromny potencjał w hodowli komórek oraz przeprowadzaniu różnego rodzaju badań, takich jak badania toksyczności. Próbowaliśmy również badać i optymalizować charakterystykę płynów wewnątrz tych urządzeń w zależności od szybkości przepływu, geometrii oraz innych parametrów. Obecnie znajdujemy się w pracowni mikrowytwarzania; naszym celem jest stworzenie kilku urządzeń mikrofluidycznych. Aby zrealizować te urządzenia, potrzebujemy wzorów na waflach krzemowych oraz form z PDMS nałożonych na nie. Polimer PDMS jest w rzeczywistości mieszaniną dwóch różnych składników.

Jest to mieszanina bazy elastomeru silikonowego oraz utwardzacza elastomeru silikonowego. Mieszamy te dwa składniki w stosunku 10:1, czyli 10 części bazy na jedną część utwardzacza. Obecnie potrzebuję około 20 g bazy.

Potrzebuję również dwóch gramów utwardzacza, a utwardzacz ma znacznie mniejszą gęstość. Będzie spływał znacznie szybciej, więc muszę zachować ostrożność. Jest teraz około 22 i chcę teraz wymieszać bazę z utwardzaczem.

W tym celu użyję pipety. Postaram się wymieszać składniki tak dokładnie, jak to możliwe. Następnie wyleję polimer PDMS na płytki krzemowe, które posiadają na swojej powierzchni wzór; płytka krzemowa posłuży do nadania odpowiedniej struktury formom z PDMS.

Można zauważyć, że mam tutaj dwa wafle krzemowe; powodem jest to, że jeden z nich służy do wykonania górnej warstwy naszego urządzenia mikrofluidycznego, a drugi do warstwy dolnej. W urządzeniach mikrofluidycznych potrzebujemy dwóch warstw, ponieważ dążymy do uzyskania kanału wewnątrz, a istotą urządzeń mikrofluidycznych jest zapewnienie przepływu w tych właśnie kanałach. Muszę wylać tę mieszaninę na oba wafle krzemowe, ponieważ w mieszaninie znajduje się wiele pęcherzyków powietrza.

Chcę usunąć te pęcherzyki powietrza, w tym celu zastosujemy próżnię. Wróciliśmy do głównej części laboratorium i, jak wcześniej wspomniałem, ponieważ w mieszaninie PDMS znajduje się wiele pęcherzyków, które chcemy usunąć, umieszczę mieszaniny na płytkach krzemowych wewnątrz komory próżniowej. Zamknę komorę i uruchomię pompę próżniową. Po zakończeniu tego etapu umieścimy formy z PDMS w piekarniku na całą noc, aby utwardzić je.

Znajdujemy się teraz w laboratorium i chcemy złożyć te urządzenia mikrofluidyczne. Wykorzystamy formy z PDMS, które przez noc znajdowały się w inkubatorze i w których utwardziły się wzory przeniesione z wafli krzemowych; użyję dwóch różnych wzorów. Po lewej stronie widoczny jest mikrokanał, który będzie stanowił warstwę górną, a po prawej wzory w postaci zielonych linii, które utworzą warstwę dolną.

W ten sposób powstaną rowki wewnątrz mikro urządzenia. Zaczynam od wycinania tych żeli, aby górna warstwa mogła łatwo oddzielić się od płytki krzemowej. Następnie przeniosę je do tych szalek Petrigo stroną górną do góry, tak aby wzory były skierowane ku górze.

To samo zrobię w przypadku rowków, które stanowią zielone wzory liniowe. Będą one tworzyć warstwę dolną. Po wycięciu żelu przeniosę go do szalki Petriego, a aby zapobiec osiadaniu kurzu na wzorach, zakleję je taśmą.

Kolejnym krokiem jest przebicie końców kanałów, aby umożliwić przepływ komórek i pożywki. Ponieważ powierzchnia jest tutaj szeroka i nie widzę wzorów gołym okiem, użyję tego narzędzia, aby móc dostrzec kanały i przebić oba ich końce. Z jednej strony wykonam większy otwór, aby zapewnić odpowiedni zapas, a z drugiej strony przebiję mały otwór, aby móc zastosować rurki z polietylenu.

Znajdujemy się teraz w pomieszczeniu do mikrowytwarzania, a kolejnym krokiem jest połączenie dwóch różnych posiadanych przez nas powierzchni. W tym celu wykorzystujemy urządzenie zwane cleanerem plazmowym, a sam proces nazywa się traktowaniem plazmą. Wewnątrz komory powstaje środowisko plazmowe, a w wyniku oddziaływania plazmy z powierzchnią dochodzi do zerwania słabych wiązań powierzchniowych i zastąpienia ich grupami chemicznymi o wysokiej reaktywności.

W tym momencie zdejmę taśmy, które zostały tu umieszczone w celu zapobiegania osadzaniu się kurzu, a następnie umieszczę formy wewnątrz komory. Zamknę całkowicie drzwi, włączę zasilanie, a następnie pompę i będziemy gotowi do pracy. Wrócimy do tego za 5 do 10 minut.

Teraz chcę wyłączyć urządzenie, więc wyłączam pompę oraz zasilanie, a następnie otwieram komorę. Wewnątrz panuje ciśnienie ujemne, więc możecie Państwo usłyszeć charakterystyczny dźwięk. Wynika to właśnie z podciśnienia, zatem powoli wyjmuję moje formy.

Ponieważ obie powierzchnie z wzorem są skierowane do góry, wezmę dolną warstwę do lewej ręki, a następnie wezmę górną warstwę, odwrócę ją i położę na moich rowkach, a potem docisnę obie warstwy do siebie. Siła i trwałość adhezji to zalety stosowania tej maszyny do obróbki plazmowej. To, co widzicie teraz, to widoczny kanał na górnej warstwie oraz wzory rowków na dolnej warstwie; całość jest gotowa do kolejnego etapu.

Następnie należy przenieść do strefy roboczej komorę inkubacyjną oraz pożywkę, a następnie otworzyć naczynie. Teraz można wprowadzić fibronektynę: należy pobrać 60 µL fibronektyny i wprowadzić ją do urządzenia. Aby wytworzyć wewnątrz urządzenia przepływ indukujący cienką warstwę powłoki z fibronektyny wewnątrz kanału, należy delikatnie odessać ciecz z wylotu.

Następnie możemy umieścić to urządzenie w inkubatorze na jedną godzinę. Po godzinie inkubacji wewnątrz inkubatora wyjmujemy próbkę, a następnie używamy trzech pędzli z włókna szklanego. Przeprowadzamy fuzję i oddzielamy komórki, po czym dodajemy pożywkę i dokonujemy zliczenia komórek za pomocą licznika komórek.

Zazwyczaj potrzebujemy miliona komórek osadzonych wewnątrz urządzenia. Po dysocjacji możemy kilkakrotnie przepłukać układ, a następnie pobrać zawiesinę komórek i wprowadzić ją do kanału. Aby lepiej załadować komórki do wnętrza kanału, można zastosować delikatny przepływ, korzystając z aspiratora.

Pożywka nadmiarowa oraz zawiesina powierzchniowa są zazwyczaj automatycznie odsysane przez wylot komórki, co pozwala na zasianie kanału głównego w sposób selektywny. Następnie można rozmontować układ i umieścić go w inkubatorze na jedną godzinę, aż komórki całkowicie rozprzestrzenią się wewnątrz kanału. Po tym czasie można wprowadzić Annexin V oraz jodek propidyny, a także nadtlenek wodoru.

Następnie przeprowadzamy analizę w celu weryfikacji hipotezy dotyczącej czasu. Próbkę pobieramy z pożywki do hodowli tkankowej, a następnie przygotowujemy roztwór zawierający 2 mL pożywki DMEM, 20 µL Annexin V, 40 µL jodeczku propidyny oraz 100 mM nadtlenku wodoru. Po przygotowaniu pożywki z dodatkiem Annexin V, jodeczku propidyny i nadtlenku wodoru, używamy strzykawki do aplikacji.

Należy przygotować dwa podłoża w ilości 2 mL oraz pięć próbek z jodekiem propidyny i nadtlenkiem wodoru. Roztwór można wprowadzić do strzykawki, następnie usunąć pęcherzyk powietrza i podłączyć C-bear. Jest to szczelna gazowo strzykawka Hamiltona o objętości 1 mL.

To jest trzy niedźwiedzie. To jest jednorazowy sufit sufity. To jest igła 27G.

Jest to rurka polietylenowa PE 20. Po pobraniu roztworu do strzykawki, należy kilkakrotnie całkowicie wysunąć tłok, a następnie delikatnie opukać strzykawkę, aby usunąć pęcherzyki powietrza i ponownie wciągnąć roztwór. Jeszcze raz: całkowicie wysunąć tłok, usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie ostrożnie powtórzyć procedurę.

Należy pobrać roztwór dla jednej próbki, a następnie przełączyć zawór. Przepychamy roztwór przez zawór trójdrożny, aż całkowicie wypełni on cewkę. Ostatecznie roztwór wypływa przez końcówkę cewki; wtedy możemy po prostu podłączyć cewkę do mikroukładu i rozpocząć infuzję z prędkością 1 µL/min.