Wykorzystanie SCOPE do identyfikacji potencjalnych motywów regulacyjnych w genach współregulowanych

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zidentyfikowanie potencjalnych sygnałów regulacyjnych w zestawach genów współregulowanych oraz zidentyfikowanie innych genów, które mogą funkcjonalnie należeć do tego zestawu. Osiąga się to poprzez wprowadzenie listy genów lub sekwencji kandydackich do algorytmu scope. W drugim kroku analizowane są wyniki badań w celu zidentyfikowania motywów o wysokiej punktacji.

Wybierany jest jeden lub więcej motywów do dalszych badań. Następnie dodatkowe geny zidentyfikowane przez program scope dla danego motywu są łączone z pierwotnym zestawem genów i ponownie wprowadzane do programu scope; uzyskane wyniki analizy wykazują wzorce motywów w nowym, rozszerzonym zestawie genów. Wzorce te służą do potwierdzenia pierwotnej identyfikacji motywu oraz do zasugerowania dodatkowych genów, które można rozważyć w dalszych badaniach biologicznych pod kątem koregulacji z genami pierwotnie wprowadzonymi do programu scope.

Główną zaletą tego podejścia jest to, że w przeciwieństwie do innych programów do wyszukiwania motywów, scope wykorzystuje podejście zespołowe, składające się z wielu różnych algorytmów, z których każdy został zaprojektowany do znajdowania konkretnego rodzaju motywu. Ponadto scope nie wymaga od użytkownika podawania informacji, których nie da się znać, takich jak długość motywu czy oczekiwana liczba wystąpień motywu. Interfejs użytkownika jest niezwykle prosty i nie wymaga żadnej specjalistycznej wiedzy w zakresie wyszukiwania sekwencji regulacyjnych.

Dzięki temu użytkownik będzie mógł przeprowadzić analizę w bardzo prosty i bezpośredni sposób. Wyniki z programu Scope mają charakter wysoce graficzny, co oznacza, że po otrzymaniu rezultatów intuicyjne jest wyszukiwanie wzorców i identyfikacja interesujących motywów. Na początek należy przygotować listę nazw genów, które mogą być współregulowane.

W celu przeprowadzenia analizy w programie scope, należy zapisać listę jako plik tekstowy lub skopiować ją do schowka, aby wkleić ją później do programu scope. Plik powinien zawierać jedną nazwę genu w każdej linii, bez żadnych dodatkowych informacji. Uruchom przeglądarkę internetową i połącz ją z podanym tutaj adresem URL.

Należy wprowadzić informacje niezbędne dla programu scope do przeprowadzenia analizy. Z menu rozwijanego wybierz gatunek poddany badaniu. Ważne jest wybranie właściwego gatunku, ponieważ program scope odwołuje się do genomu w celu obliczenia tła częstotliwości występowania.

W przypadku każdego kandydującego motywu analizowana jest sekwencja powyżej (upstream). Przyciski radiowe służą do wyboru opcji: międzygenowej (intergenic) lub o stałej długości (fixed length). Opcja międzygenowa analizuje całą sekwencję pomiędzy badanym genem a genem poprzedzającym, natomiast wybór stałej długości pozwala przeanalizować dokładnie określoną liczbę nukleotydów powyżej początku obecnego genu.

Następnie należy wskazać programowi scope zestaw genów do analizy, wklejając listę genów lub sekwencję fast do pola tekstowego listy genów lub klikając przycisk wyboru pliku, aby zaznaczyć odpowiedni plik. Sekcję wyników należy uwzględnić, wpisując motyw, który program scope ma objąć analizą, co jest przydatne podczas poszukiwania konkretnego motywu. Ostatnią sekcję na stronie można wykorzystać do wprowadzenia adresu e-mail oraz komentarza, które zostaną zapisane wraz z analizą.

Jeśli to pole zostanie wypełnione w zakresie, zostanie wysłana wiadomość e-mail z linkiem powrotnym do strony internetowej zawierającej wyniki. Po opisaniu parametrów zakresu przycisk próbnego wyszukiwania zostanie użyty do zademonstrowania sposobu uruchamiania programu zakresu. Naciśnięcie tego przycisku automatycznie uzupełni wszystkie niezbędne informacje, które zostały opisane dla uruchomienia ręcznego.

Trzy geny są wprowadzane automatycznie, a dla pozostałych pól wybierane są odpowiednie opcje. Te trzy geny biorą udział w utrzymaniu telomerów poprzez rekombinację w croce visier. Pozostawienie zaznaczonej opcji dodatkowych genów spowoduje, że program scope przeszuka genom i zidentyfikuje wszystkie pozostałe geny posiadające ten motyw w regionie upstream, co doprowadzi do zwiększenia wyniku motywu po dodaniu ich do pierwotnego zestawu genów.

Na koniec rozpocznij analizę, naciskając przycisk run scope u dołu strony. Po zakończeniu analizy wyniki zostaną wyświetlone na ekranie. W górnej części strony znajduje się tabela z informacjami o motywach znalezionych za pomocą scope.

Pierwsza kolumna zawiera listę znalezionych motywów, a małe kolorowe kwadraty służą jako legenda dla graficznej mapy motywów przedstawionej poniżej. Wyświetlanie dowolnego motywu można włączyć lub wyłączyć, klikając w kolorowe pole. Pozostałe kolumny danych obejmują: count – liczbę wystąpień motywu w całym zbiorze genów, sig value – wskaźnik istotności danego motywu, coverage – ułamek przesłanych genów zawierających co najmniej jedną instancję tego motywu oraz algorithm – informację o tym, który z trzech algorytmów komponentu zakresu został użyty do wykrycia motywu.

Kliknięcie dowolnego z wymienionych motywów przeniesie użytkownika na stronę zawierającą szczegółowe informacje na jego temat. Na tej stronie motyw jest przedstawiony w trzech formach: jako logo sekwencji, macierz wag pozycji oraz lista wszystkich wystąpień motywu wraz z ich pozycjami, nićmi i genami.

Dalej na stronie znajdują się dodatkowe szczegóły dotyczące wyników poszukiwań innych genów zawierających ten motyw. W tym przypadku znaleziono 65 innych genów zawierających ten motyw, z których każdy poprawił wartość SIG po dodaniu do oryginalnego zbioru genów. Kliknięcie przycisku „dodaj sprawdź geny do wyszukania” spowoduje powrót do strony konfiguracji zakresu.

Po dodaniu tych genów do pierwotnego zestawu genów oraz przy zachowaniu parametrów stosowanych wcześniej w tym przykładzie, do początkowych trzech genów dodano 10 dodatkowych genów. Wyniki analizy zakresu dla dodatkowych genów w tym motywie przedstawiono tutaj. Pierwotne trzy geny znajdują się na dole wyników.

Analiza wzorca motywów w regionie powyżej tych dodatkowych genów wyraźnie pokazuje, że są one podobne. Pierwotny motyw jest obecnie motywem o najwyższej punktacji w zestawie; przedstawiony tutaj jest dodatkowy wynik analizy innego zestawu genów zaangażowanych w biogenezę rybosomów. Wyraźnie widoczny jest wzorzec dwóch motywów, który można zaobserwować u większości badanych genów.

Graficzna reprezentacja wyników programu scope sprawia, że tego rodzaju wzorce są dla użytkownika bardzo łatwe do rozpoznania. W przeciwieństwie do wielu innych programów do wyszukiwania motywów, scope nie wymaga od użytkownika zgadywania długości motywu ani rodzaju motywów, których program powinien szukać. Niezależnie od tego, czy jesteś ekspertem, czy osobą początkującą, scope posiada ten sam interfejs i zapewni Ci takie same wyniki.

Ponadto zdolność programu scope do wyszukiwania innych genów, które mogą być współregulowane z początkowym zestawem genów, dostarcza nowych pomysłów do eksperymentów biologicznych. Podejście zespołowe zazwyczaj oznacza, że scope zwróci najbardziej znaczące wyniki, często znacznie dokładniej niż inne narzędzia do wyszukiwania motywów. Należy jednak pamiętać, że ostatecznym interpretatorem wyników pozostaje naukowiec zajmujący się naukami biologicznymi.

Niezależnie od tego, co wskaże komputer, wyniki muszą być spójne z kontekstem biologicznym.