Wyznaczanie skłonności do oligomeryzacji domeny transbłonowej za pomocą testu ToxR

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zbadanie tendencji do ligamentyzacji białek, domen transbłonowych lub TMD w naturalnym środowisku błonowym. Jest to osiągane poprzez ekspresję interesującej domeny transbłonowej w e coli jako białka chimerycznego z białkiem wiążącym maltozę w celu lokalizacji w periplazmie oraz tox R jako reportera transkrypcyjnego; indukowana domeną transbłonową ligamentyzacja prowadzi do dimeryzacji tox R i aktywacji transkrypcji LXi. W drugim kroku komórki są lizowane i traktowane ONPG, który jest hydrolizowany przez beta galacto do absorbującego światło o-nitrofenolu lub ONP.

Następnie poziomy ONP są kwantyfikowane poprzez pomiar absorbancji światła przy 405 nanometrach. W celu określenia poziomów domeny transbłonowej, wyniki ligantyzacji wykazują skłonność do ligantyzacji domen transbłonowych na podstawie testu reporterowego tox R. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod biofizycznych, takich jak SDS-PAGE lub fluorescencja, jest to, że zachowanie domeny transbłonowej jest badane w naturalnej dwuwarstwie fosfolipidowej poprzez ekspresję w E. coli, a nie w systemie naśladującym błonę, takim jak detergenty.

Ta metoda może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny białek błonowych, takie jak wyjaśnienie kluczowych cech strukturalnych biorących udział w asocjacji helis transbłonowych. Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu przygotowuje się siedem plazmidów eksprymujących wymagane białko chimeryczne z komercyjnie syntetyzowanych oligonukleotydów, reprezentujących interesującą sekwencję TDS, flankowaną miejscami restrykcyjnymi NHE I oraz BamH I. Po przygotowaniu plazmidów należy ostrożnie rozmrozić kompetentne komórki fhk 12 na lodzie. Po rozmrożeniu komórki przenosi się do probówek hodowlanych o pojemności 15 ml, dodając 200 ng każdego plazmidowego DNA do osobnej probówki, a następnie inkubuje komórki na lodzie przez 30 minut.

Następnie przeprowadź szok termiczny komórek przez 90 sekund w temperaturze 42 °C, a następnie inkubuj je na lodzie przez dwie minuty w 800 µL pożywki SOC. Próbki inkubuj w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez jedną godzinę. Po inkubacji zaszczep 5 mL pożywki LB zawierającej chloramfenikol i ampicylinę za pomocą 50 µL mieszaniny transformacyjnej, wykorzystując probówki do hodowli o pojemności 15 mL, wykonując trzy powtórzenia dla każdej próbki. Na koniec inkubuj próbki w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 20 godzin. Aby zmierzyć efektywność ligacji, oznacz aktywność β-galaktozydazy TDS.

W pierwszej kolejności rozgrzej czytnik płytek do 28 °C. Przygotuj świeże roztwory buforu Z ze stoku buforu Z zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Przenieś chloroformowy bufor Z z probówki do zbiorniczka, upewniając się, że pipetujesz wyłącznie górną warstwę wodną chloroformowego buforu Z.

Umieść płytkę 96-dołkową na kartce z narysowaną siatką, aby zapewnić dokładne pipetowanie; przenieś 100 µL buforu Z z chloroformem do każdego dołka płytki 96-dołkowej, a następnie dodaj po 5 µL każdej kultury w czterech powtórzeniach. Z pominięciem kultur przygotuj cztery dołki, które będą służyć jako próbki ślepe. Zmierz OD 595 płytki, aby określić gęstość komórek.

Do wszystkich dołków płytki dodaj 50 µL buforu Z SDS. Następnie wstrząśnij płytką w czytniku płytek przez 10 minut w celu lizy komórek, a następnie do wszystkich dołków dodaj 50 µL ZPA dla ONPG. Włóż płytkę z powrotem do czytnika i mierz OD 405 co 30 sekund przez 20 minut.

Wyznacz poziom aktywności beta-laktamazy poprzez obliczenie jednostek Millera z normalizacją względem próby ślepej. Wykonuje się western blotting w celu weryfikacji równoważnej ekspresji białka pomiędzy konstruktami. Najpierw połącz 50 µL kultur z trzech powtórzeń, a następnie odwiruj próbki w mikrocentryfudze.

Usunąć nadsącz za pomocą pipety i ponownie zawiesić. Pozostały osad zawiesić w dwukrotnym buforze do nakładania próbek, a następnie nałożyć 7,5 µL każdej próbki na standardowy żel 8% i przeprowadzić elektroforezę przy napięciu 125 V przez jedną godzinę i pięć minut. Po transferze inkubować membranę z przeciwciałem sprzężonym z anty-M-V-P-H-R-P w celu wizualizacji; białko chimeryczne jest obserwowane przy masie około 70 kDa, przy czym niekiedy widoczne są produkty degradacji w okolicy 48 kDa.

Endogenny MVP jest również obserwowany przy 45 kilodaltonach. Aby ocenić prawidłową insercję w błonę chimerycznego konstruktu TMD, wykorzystuje się linię komórkową PD 28 z deficytem białka wiążącego maltozę; podczas hodowli w pożywce minimalnej z maltozą jako jedynym źródłem węgla mogą rosnąć tylko komórki wykazujące produkt ekspresji zintegrowany z błoną, w którym białko wiążące maltozę jest prawidłowo zlokalizowane w periplazmie. Transformuj komórki PD 28 zgodnie z opisem dla komórek fhk 12 i zaszczep dwa mililitry pożywki LB.

Hodować komórki w temperaturze 37°C przy wytrząsaniu z prędkością 300 RPM przez noc po inkubacji. Osadzić komórki poprzez wirowanie i przemyć, resuspendując je w dwóch mililitrach PBS i delikatnie pipetując za pomocą końcówki o dużej objętości. Po osadzeniu komórki ponownie przemyć PBS po raz drugi, a następnie przeprowadzić końcowe wirowanie i resuspendować w jednym mililitrze PBS.

Użyj 25 µL zawiesiny komórek do zaszczepienia 5 mL pożywki minimalnej. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 15 godzin. Przenieś 200 µL każdej próbki do płytki 96-dołkowej i zmierz absorbancję przy OD 595 za pomocą czytnika płytek.

Powtarzaj ten proces co dwie godziny przez 25 godzin. Analizowano skłonność do ligandyzacji wszystkich poszczególnych domen transbłonowych wieloprzeponowego integralnego białka błonowego latent membrane protein one z wykorzystaniem testu reporterowego transkrypcyjnego tox R. Domena transbłonowa pięć wykazuje silną skłonność do ligandyzacji, co potwierdzają wysokie jednostki Millera, porównywalne z pozytywną kontrolą GPAA, będącą dobrze udokumentowaną sekwencją dimeryzującą.

Szkodliwa mutacja w piątej domenie transbłonowej D1 50A zmniejsza zdolność sekwencji do wiązania LMP1; TM1 nie wykazuje znaczącego wiązania i generuje bardzo niski sygnał w jednostkach Millera, znajdujący się tuż powyżej sygnału dla próby kontrolnej, którą stanowią nietransformowane komórki FHK 12. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak określić, czy analizowana helisa transbłonowa ma zdolność do tworzenia kompleksów wyższego rzędu w naturalnym środowisku błonowym. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest niezwykle precyzyjne pipetowanie do płytki 96-dołkowej, aby uniknąć dużych błędów i upewnić się, że nie wprowadzono pęcherzyków powietrza.