Znakowanie bromodeoksyurydyną (BrdU) oraz następujące po nim sortowanie komórek metodą fluorescencji w celu niezależnej od hodowli identyfikacji bakterioplanktonu degradującego rozpuszczony węgiel organiczny

Mikroorganizmy pośredniczą w degradacji licznych substratów rozpuszczonego węgla organicznego lub związków DOC w środowiskach wodnych. Aby w pełni zrozumieć rolę mikroorganizmów w transformacji DOC, niezbędna jest jednoczesna identyfikacja ich taksonomii i funkcji. Niniejszy film prezentuje procedurę identyfikacji taksonomicznej wolno żyjących bakterii lub planktonu bakteryjnego, które transformują określone pule DOC w środowiskach wodnych.

Próbki wody pobrane ze środowiska testowego są przetwarzane i inkubowane z badanym związkiem oraz bromo-deoksyurydyną (BRDU), która wbudowuje się w nowo syntetyzowany DNA i aktywnie rosnące komórki. Następnie plankton bakteryjny znakowany BRDU jest znakowany przeciwciałami anty-BRDU sprzężonymi z ZI. Plankton bakteryjny o wysokim poziomie znakowania BRDU jest izolowany za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS).

Następnie z posortowanych komórek ekstrahuje się DNA, a identyfikację taksonomiczną przeprowadza się na podstawie wyników analizy genu 16 s rRNA z wykorzystaniem techniki PCR. Cześć, nazywam się Steven Robbins i pochodzę z laboratorium dr. Chen Mao z Katedry Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Kent State. Dzisiaj wraz z Lu zaprezentujemy Państwu metodę niezależną od hodowli, służącą do identyfikacji planktonu bakteryjnego degradującego DOC w środowiskach wodnych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wzbogacanie składników odżywczych z późniejszą analizą DNA społeczności bakteryjnej, jest to, że koncentruje ona analizę na bakteriach o wysokiej aktywności i wyklucza komórki uśpione oraz wolno rosnące. Przedstawiamy tutaj identyfikację planktonu bakteryjnego wykorzystującego jeden konkretny związek DOC. Metoda ta może być jednak zastosowana również do badania planktonu bakteryjnego wykorzystującego inny pojedynczy związek DOC lub grupę DLC, takich jak eksudaty algalne.

Pobierzmy zatem próbki wody i zacznijmy. Przed przeprowadzeniem analizy próbek wody pod kątem planktonu bakteryjnego degradującego DOC, próbki wody muszą zostać odpowiednio przygotowane. Próbki pokazane tutaj zostały pobrane z wybrzeża Georgii; należy usunąć z nich duże cząstki oraz ER VRE.

Użyj pompy perystaltycznej, aby przenieść wodę z gąsiora zbiorczego do jednostki filtracyjnej z filtrem o rozmiarze porów 1 µm. Następnie przenieś 36 ml aliquotów filtrate do trzech sterylnych probówek polipropylenowych o pojemności 50 ml. Każda z nich powinna zawierać 4 ml świeżo przygotowanego 10% roztworu paraformaldehydu. Inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby zakonserwować komórki po inkubacji.

Wlej wodę do wieży filtracyjnej szklanego zestawu do filtracji próżniowej z białymi membranami filtracyjnymi o rozmiarze porów 0,22 µm i zastosuj podciśnienie, aby przeciągnąć roztwór przez filtr. Przemyj filtr, przepuszczając przez niego 10 mL PBS za pomocą filtracji próżniowej. Oznacz filtry jako kontrole negatywne i przechowuj je w temperaturze -20 °C.

Aby utworzyć eksperymentalny ekosystem lub mikrokosmos, należy najpierw napełnić sześć uprzednio wypłukanych szklanych kolb o pojemności jednego litra 800 mililitrami przefiltrowanej próbki wody. Do każdego mikrokosmosu dodać BRDU do stężenia końcowego 10 micromolar. Kolbę szybko obrócić ręcznie w celu wymieszania zawartości.

Każda próbka zostanie poddana analizie w trzech powtórzeniach. Do trzech mikrokosmosów należy zatem dodać modelowy związek DOC. W tym przypadku do mikrokosmosów dodawany jest reine w końcowym stężeniu 100 nanomolar.

Następnie do pozostałych trzech mikrokosmosów należy dodać sterylny PBS. Będą one służyć jako kontrole bez DOC. Wszystkie mikrokosmosy należy umieścić w inkubatorze z wytrząsarką ustawionym na 100 RPM, w ciemności, w temperaturze in situ wynoszącej 25 °C. Próbki pobiera się w punktach czasowych 0, 8, 16 i 24 godziny.

Pobrać 36 mililitrów z każdego mikrokosmosu do sterylnej probówki z polipropylenu o pojemności 50 mililitrów zawierającej cztery mililitry świeżego 10%paraform aldehydu; inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia komórek. Następnie przefiltrować utrwalone komórki przez białe filtry membranowe o rozmiarze porów 0,22 mikrometra. Przepuścić 10 mililitrów PBS przez filtr próżniowy, aby wypłukać pozostałości PFA.

Należy niezwłocznie przejść do detekcji immunologicznej INS in situ lub przechowywać filtry w temperaturze -20 °C w celu analizy inkorporacji BRDU do planktonu bakteryjnego. Rozpocząć należy od doprowadzenia filtrów z próbkami do temperatury pokojowej, aby naruszyć ścianę komórkową bakterii. Umieścić filtr w jednostce filtracyjnej, a następnie pipetą nanieść 1 mL roztworu lizozymu na filtr, aby pokryć komórki, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Po inkubacji zastosuj próżnię, aby usunąć roztwór. Gdy roztwór przejdzie przez filtr, przemyj komórki, dodając 10 mililitrów PBS i ponownie stosując próżnię. Następnie, aby dalej uszkodzić ścianę komórkową, dodaj na filtr jeden mililitr roztworu proteinazy K, tak aby pokrył on komórki.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przemyć PBS, aby uzyskać pojedyncze warstwy DNA. Dodać jeden mililitr roztworu egzonukleazy, aby pokryć komórki na filtrze.

Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji przemyć filtr, przepuszczając 10 ml PBS przez filtr próżniowy. Następnie odciąć krawędzie filtra, aby usunąć fragmenty pozbawione komórek.

Następnie na suchej powierzchni oczyszczonej alkoholem, przy użyciu sterylnego ostrza, należy pociąć filtr na osiem równych części. Dla każdej próbki wymagane są osiem komór inkubacyjnych z uszczelką ramową; jedną ósmą część filtra należy umieścić w zmontowanej komorze inkubacyjnej z uszczelką ramową stroną z próbką do góry. Po zmontowaniu komór należy użyć zestawu Roche Intu cell proliferation kit do detekcji komórek znakowanych A-B-R-D-U in situ.

Po zakończeniu procedur stacjonarnych należy wyjąć sekcję filtra z komory inkubacyjnej i umieścić ją na sterylnej powierzchni; następnie za pomocą sterylnego ostrza pokroić sekcję filtra na małe kawałki. Przenieść kawałki filtra do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml PBS, szczelnie zamknąć probówkę i zabezpieczyć ją parafilmem. Następnie inkubować probówkę w inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 37 °C i przy 200 RPM przez 10 minut.

Po inkubacji należy zabezpieczyć probówkę i wymieszać ją w wirówce typu vortex z maksymalną prędkością. Przez pięć minut pipetować nadsącz (SUP) do sterylnej polipropylenowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie resuspender filtr w PBS i powtórzyć etapy wirowania w vortexie oraz inkubacji jeszcze dwukrotnie, za każdym razem dodając nadsącz do tej samej probówki o pojemności 15 mililitrów dla każdej próbki.

Przechowywać resuspenderowane komórki w temperaturze 4°C. Próbkę należy przeanalizować metodą FACS w ciągu dwóch dni. Na koniec należy przeprowadzić sortowanie komórek w celu wyizolowania populacji o wysokim poziomie wbudowania BrDU.

W niniejszym protokole wykorzystano cytometr przepływowy BD FACS oraz odpowiednie oprogramowanie. Po posortowaniu komórek można przeprowadzić analizę populacji wzbogaconej w BrDU w celu określenia jej tożsamości taksonomicznej. Aby przeprowadzić PCR w celu amplifikacji genów 16S rRNA posortowanych bakterii, należy pipetować posortowane komórki na białą membranę filtracyjną z poliwęglanu o rozmiarze porów 0.22 µm, włączyć pompę próżniową, a następnie za pomocą sterylnego ostrza odciąć brzegi filtra wolne od komórek.

Podziel filtr na cztery równe części dla każdego z warunków, a następnie umieść pojedynczy fragment filtra w każdej z trzech probówek do PCR, tak aby komórki były skierowane do wnętrza probówki. Dodaj 45 µL wody klasy PCR. Pozostaw fragment filtra do całkowitego zanurzenia w wodzie.

Następnie należy dodać dwa koraliki Roche illustra pure T ready to go PCR i krótko zawirulować próbkę, aby pomóc w rozpuszczeniu koralików. Następnie dodaje się po 2 µL starterów forward i reverse dla genu 16 s ribosomal RNA.

Należy dodać jeden mikrolitr BSA w celu pomocy w absorpcji inhibitorów amplifikacji lub jeden mikrolitr wody. Następnie przeprowadza się amplifikację PCR w termocyklerze. Zalecane jest zastosowanie programu touchdown PCR, w którym temperatura przyłączania sukcesywnie obniża się od 62 do 52 °C o jeden stopień Celsjusza w każdym cyklu, a następnie wykonuje się 15 cykli w temperaturze 52 °C.

Potwierdź amplifikację PCR za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych 1% barwionych bromkiem etydinium, wytnij amplikony PCR z żelu i oczyść je za pomocą zestawu KaiGen cayo quick gel extraction kit. Po oczyszczaniu żelowym PCR połącz amplikony z tej samej próbki. Oczyszczone amplikony rybosomalnego DNA 16 s są teraz gotowe do szeregu analiz molekularnych.

Próbki pobrano z obszaru nadmorskiego w stanie Georgia i poddano obróbce w celu zbadania bakterii degradujących racinę, zgodnie z procedurami opisanymi w tym filmie. Racina jest związkiem poliamidowym, który powszechnie występuje w środowiskach morskich. Może ona służyć jako źródło substancji odżywczych i energii dla bakterii morskich, co pokazano tutaj.

Analiza faktów dotycząca próbek wykazała, że po 24-godzinnej inkubacji w mikrokosmosach wzbogaconych o Racine rozwinęła się grupa bakterii o wyższej intensywności fluorescencji FXI, która była dodatnio skorelowana ze stopniem wbudowania BRDU. Komórki te określono jako komórki o wysokim wbudowaniu BRDU lub HI i oczekiwano, że będą one zawierać głównie bakterie degradujące Racine. Brak HI.

Komórki stwierdzono w kontrolach bez dodatków, które zawierały jedynie komórki z niższym poziomem wbudowania BRDU, określane jako komórki lii; oczekiwano, że będą one zawierały głównie plankton bakteryjny, który nie był w stanie go wykorzystać. Dodane komórki Racine HI zostały posortowane do oddzielnych probówek, a następnie zebrane na filtry membranowe. Częściowe amplikony genu 16S rRNA uzyskano po przeprowadzeniu reakcji PCR z filtra i potwierdzono za pomocą elektroforezy żelowej.

Po filtracji sortującej można również przeprowadzić amplifikację PCR genów funkcjonalnych, aby zbadać różnorodność funkcjonalną wśród posortowanych komórek. Przedstawiliśmy sposób fizycznej separacji i identyfikacji funkcjonalnych komórek bakteryjnych w środowisku wodnym przy użyciu podejścia łączącego sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i wbudowywanie BrDU. Pamiętaj, że BrDU jest szkodliwe; podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić fartuch laboratoryjny i rękawiczki.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.