Zastosowanie mikrofluidyki w elektrofizjologii
1 października 2007
Nazywam się Dave Edington. Jestem adiunktem w Katedrze Bioinżynierii na University of Illinois w Chicago. Obszar, nad którym głównie pracujemy, to zastosowanie mikrotechnologii w aplikacjach biomedycznych, a w szczególności wykorzystanie urządzeń mikroprzepływowych.
Dzisiaj zaprezentujemy jeden z naszych projektów, który polega na wykorzystaniu urządzenia mikroprzepływowego dostosowanego do standardnej komory perfuzyjnej do skrawków mózgu, w celu zapewnienia czasowo-przestrzennej stymulacji skrawka mózgu. Obecnie w preparatach skrawków do elektrofizjologii głównymi metodami aplikacji neuroprzekaźników do skrawka jest albo podawanie globalne na cały skrawek mózgu, co oznacza stymulację całego skrawka w tym samym czasie, albo wykorzystanie mikropipety do pulsacyjnego podawania neuroprzekaźników w różnych punktach czasowych.
Przekrój mózgu jest bardzo złożoną strukturą i przy globalnym podawaniu neurotransmiterów lub użyciu mikropipety nie jest możliwe odtworzenie wzorców stymulacji in vivo. Dzięki naszej platformie jesteśmy w stanie kontrolować stymulację w bardzo konkretnych obszarach całego przekroju mózgu i uzyskać stymulację bardziej zbliżoną do warunków in vivo. Tutaj pokazano aktualne systemy perfuzyjne w momencie ich połączenia ze standardowym szkiełkiem podstawowym.
Umożliwia to perfuzję pożywki przez cały skrawek. Jednakże, nie można w ten sposób kontrolować przestrzennej rozdzielczości podawanego przez urządzenie stymulujące neuroprzekaźnika. Dlatego opracowaliśmy urządzenie micro flic, które łączy się z tą standardową komorą perfuzyjną.
Zatem można zastosować wszystkie standardowe testy elektrofizjologiczne. Jedyną odmienną cechą jest to, że zamiast szklanego denka zastosowano urządzenie z PDMS, które posiada kilka otworów przelotowych łączących się z kanałami mikroprzepływowymi. Te z kolei łączą się z otworami w górnej komorze perfuzyjnej, co pozwala nam stymulować neurotransmitery poprzez te otwory, kanały i przelotki bezpośrednio do skrawka mózgu. Do dostarczania płynów wykorzystujemy technikę zwaną pompowaniem pasywnym.
Dzięki temu nie potrzebujemy żadnych skomplikowanych przewodów wychodzących z tego urządzenia, ponieważ elektrofizjologia jest już samą w sobie bardzo złożoną procedurą. Upraszczając konstrukcję urządzenia i stosując pompowanie pasywne, upraszczamy protokół eksperymentalny związany z zastosowaniem tego urządzenia mikroprzepływowego. Struktura urządzenia stanowi dwuwarstwową sieć mikroprzepływową.
Pierwszą warstwą są kanały prowadzące, które łączą się z portami wylotowymi, a druga warstwa składa się z przelotek, które łączą te kanały z studnią. Proces wytwarzania ten jest realizowany przy użyciu standardowych etapów mikrofabrykacji dwuwarstwowej, w której zastosowano znaczniki wyrównania zapewniające rozmieszczenie tych przelotek bezpośrednio w centrum tych czterech kanałów. Urządzenie to zostało zaprojektowane tak, aby można było je zintegrować ze standardową komorą perfuzyjną, dzięki czemu możliwe jest zastosowanie tych samych testów elektrofizjologicznych.
Dzięki temu możemy umieścić to na zestawie do elektrofizjologii, wprowadzić do niego obiektyw oraz zapewnić stymulację lokalną poprzez kanały mikroprzepływowe, nie komplikując niepotrzebnie układu eksperymentalnego ponad to, co jest wymagane. Utrzymując prostotę konstrukcji urządzenia, możemy znacznie łatwiej upowszechnić tę platformę. W naszej obecnej strukturze znajdują się cztery kształty litery V w środku kanałów mikroprzepływowych, ale można je dostosować do potrzeb różnych laboratoriów, w zależności od tego, który obszar mózgu jest badany.
W ten sposób jeden region mógłby służyć do badania hipokampa, a inny kory zewnętrznej. Możemy stymulować te regiony w zależności od tego, jak zaprojektujemy to urządzenie mikrofluidyczne. Ponieważ urządzenie do pracy nie wymaga zewnętrznych komponentów, wystarczy mikropipeta, aby nanieść próbki do tych otworów, wykorzystując technikę pompowania pasywnego.
Poza wspomnianym podłożem dolnym standardowe laboratorium elektrofizjologii nie musi nabywać żadnego dodatkowego sprzętu, aby móc korzystać z tego urządzenia. Do tej pory w projekcie skupialiśmy się na połączeniu kanałów mikrofluidycznych ze standardowymi komorami perfuzyjnymi. Kolejnym etapem projektu jest przeprowadzenie testów urządzenia w ramach rzeczywistych badań opartych na postawionych hipotezach, z wykorzystaniem tych preparatów skrawków.
W ten sposób wykazaliśmy, że dzięki zastosowaniu barwnika fluorescencyjnego możemy stymulować przestrzennie różne regiony poprzez wstrzykiwanie tych analogów fluorescencyjnych do kanałów. Kolejnym krokiem jest przeprowadzenie właściwych eksperymentów biologicznych. Dziedzina mikrofluidyki znajduje się zatem w punkcie przejścia.
Wykraczamy poza nowatorskie demonstracje dowodu koncepcji i zaczynamy faktycznie wykorzystywać te urządzenia do odkrywania nowych i fascynujących zjawisk, których badanie było wcześniej niemożliwe. Dziedzina ta ewoluuje zatem od technik opartych na zasadach dostępnych w mikroskali, takich jak szybka dyfuzja, przepływ laminarny, wysokie stosunki powierzchni do objętości oraz integracja procesów. Obecnie będziemy wykorzystywać i stosować te rozwiązania w celu zaspokojenia niezaspokojonych potrzeb w laboratorium oraz w praktyce klinicznej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia zastosowanie urządzeń mikroprzepływowych w neuronauce, a konkretnie do czasowo-przestrzennej stymulacji skrawków mózgu. Metoda ta zwiększa precyzję aplikacji neuroprzekaźników w porównaniu z tradycyjnymi technikami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Bioinżynieria
- Mikrofluidyka
Wstęp
- Przygotowania skrawków do badań elektrofizjologicznych są powszechnie stosowane w neuronauce.
- Obecne metody aplikacji neuroprzekaźników są ograniczone pod względem precyzji.
- Urządzenia mikroprzepływowe oferują nowatorskie podejście do usprawnienia technik stymulacji.
- Standardowe komory perfuzyjne do skrawków mózgu mogą zostać zmodyfikowane w celu poprawy ich funkcjonalności.
Cel badania
- Zaprezentowanie urządzenia mikrofluidycznego umożliwiającego przestrzennie i czasowo kontrolowaną stymulację skrawków mózgu.
- Udoskonalenie sposobu aplikacji neuroprzekaźników w badaniach elektrofizjologicznych.
- Zapewnienie bardziej kontrolowanego środowiska dla eksperymentów na skrawkach mózgu.
Zastosowane metody
- Opracowanie urządzenia mikrofluidycznego kompatybilnego z komorami perfuzyjnymi do skrawków mózgu.
- Aplikacja neuroprzekaźników z wykorzystaniem systemu mikrofluidycznego.
- Porównanie technik stymulacji: globalnej i zlokalizowanej.
- Pomiary elektrofizjologiczne w celu oceny skuteczności stymulacji.
Główne wyniki
- Urządzenie mikroprzepływowe umożliwia precyzyjną kontrolę dostarczania neuroprzekaźników.
- Stymulacja przestrzenno-czasowa wykazuje lepsze wyniki w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Ulepszone wyniki eksperymentalne w preparatach skrawków mózgu.
- Potencjał do szerszych zastosowań w badaniach nad neuronauką.
Wnioski
- Urządzenia mikrofluidyczne znacząco usprawniają aplikację neuroprzekaźników w skrawkach mózgu.
- Technologia ta może przyczynić się do rozwoju badań elektrofizjologicznych i pokrewnych kierunków badawczych.
- Przyszłe badania mogą zgłębić dodatkowe zastosowania tej metody.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta integracja mikroprzepływowości z elektrofizjologią odpowiada na kluczową, niezaspokojoną potrzebę w odkryciach neuronaukowych: osiągnięcie kontrolowanego przestrzennie i czasowo dostarczania neuromodulatorów do skrawków mózgu. Dzięki umożliwieniu regionowo specyficznych wzorców stymulacji, które lepiej naśladują warunki in vivo, platforma ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego w programach odkrywania leków na OUN. Uproszczona konstrukcja z pasywnym pompowaniem wspiera szerokie zastosowanie w procesach elektrofizjologicznych bez konieczności posiadania specjalistycznej infrastruktury.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez precyzyjną przestrzenną kontrolę aplikacji neuromodulatorów w określonych obszarach mózgu.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność manipulowania mikropipetą, co zmniejsza zmienność techniczną w eksperymentach dotyczących dostarczania neuroprzekaźników.
- Wartość predykcyjna: Wspiera walidację funkcjonalną celów poprzez odtwarzanie wzorców stymulacji bardziej istotnych fizjologicznie niż w przypadku perfuzji globalnej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy skrawków mózgu do późniejszego przesiewania związków poprzez ustanowienie powtarzalnych protokołów stymulacji zlokalizowanej.
- Wynik ilościowy: Umożliwia pomiar specyficznych dla regionu odpowiedzi elektrofizjologicznych, co pozwala na analizy zależne od dawki oraz analizy kinetyczne.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Dostosowuje się do różnych regionów mózgu (np. hipokampa, kory) poprzez zmianę projektu kanałów mikroprzepływowych, co wspiera kampanie przesiewowe ukierunkowane na wiele celów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etapy odkrywania i badań przedklinicznych, zapewniając system istotny dla danej jednostki chorobowej do testowania efektów neuromodulatorów w ustrukturyzowanej tkance neuronalnej.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia specyficzne dla danej ścieżki działanie leków poprzez izolowaną stymulację regionalną, co zmniejsza niejednoznaczność w badaniach nad oddziaływaniem na cel molekularny.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez wczesne ujawnianie zależności skuteczności od regionu oraz sygnałów poza celem w procesie odkrywania leków.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesów odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu po ocenę przedkliniczną, umożliwiając prowadzenie badań mechanistycznych z rozdzielczością przestrzenną, co zwiększa pewność w wyborze celów w OUN oraz w optymalizacji związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie izolacji zmiennych niezależnych (np. regionalnej ekspozycji na neuromodulatory) w złożonych preparatach neuronalnych.
- Screening: Zwiększa powtarzalność testów i precyzję odczytów ilościowych dzięki standaryzowanemu dostarczaniu płynów przez kanały mikrofluidyczne za pomocą pompy pasywnej.
- Analityka: Generuje specyficzne dla danych warunków pomiary elektrofizjologiczne, które pozwalają zespołom porównywać odpowiedzi regionalne oraz oceniać potencję i selektywność stymulantów.
- Badania translacyjne: Zapewniają ciągłość przedkliniczną poprzez wykorzystanie skrawków mózgu jako systemu istotnego dla danej choroby do oceny efektów neuromodulatorów w zachowanej architekturze tkankowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zaprojektowano jako platformę wielokrotnego użytku, kompatybilną ze standardowymi komorami perfuzyjnymi, co minimalizuje potrzebę ponownej walidacji w różnych laboratoriach i projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki stymulacji kontrolowanej przestrzennie.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność dzięki pompowaniu pasywnemu, eliminując zależność od zewnętrznych pomp lub złożonych układów rurek.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność kapitałową, umożliwiając multipleksowe testowanie regionalne w ramach jednej konfiguracji elektrofizjologicznej, co redukuje konieczność powielania analiz.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczanie wyraźniejszych danych dotyczących zależności struktura-aktywność oraz zaangażowania celu w różnych podregionach mózgu.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze urządzeń mikrofluidycznych oraz integracji z układem elektrofizjologicznym.
- Zależne od dostępu do standardowych komór perfuzyjnych do skrawków mózgu i systemów obrazowania mikroskopowego.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójnego dokowania urządzeń i wyrównania kanałów przez różnych użytkowników.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy celowaniu w różne obszary mózgu poprzez przeprojektowanie mikrofluidyczne układów przelotek i kanałów.
- Ograniczone przez konieczność walidacji fluorescencyjnej lub elektrofizjologicznej w celu potwierdzenia skutecznego dostarczenia neuromodulatora do obszarów docelowych.
