Zautomatyzowany dobór kolumny do hydrofobowej chromatografii oddzielania w celu oczyszczania białek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wybór optymalnej kolumny do chromatografii cieczowej HI przy użyciu zautomatyzowanej metody przesiewowej (scouting method) w celu oczyszczania białka rekombinowanego za pomocą systemu do średniociśnieniowej chromatografii cieczowej BioRad DUO flow. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez wstępne przygotowanie niezbędnych buforów oraz lizatów bakteryjnych zawierających analizowane białko rekombinowane. Następnie system chromatograficzny duo flow jest fizycznie konfigurowany, podłączany i przygotowywany do realizacji protokołu przesiewowego.

Następnie wprowadza się próbki i uruchamia zaprogramowaną metodę przesiewową dla kolumny HI w celu zebrania frakcji elucji (EIT). Na koniec analizuje się EIT i na podstawie zaobserwowanych charakterystyk rozdziału identyfikuje się optymalną kolumnę HI oraz wypełnienie. W rezultacie można uzyskać dane wskazujące preferowane wypełnienie kolumny HI do skalowanego oczyszczania białka badanego przez naukowca za pomocą średniociśnieniowej chromatografii cieczowej, wykorzystując zautomatyzowane możliwości przesiewowe kolumn HI systemu DUO flow.

Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak sekwencyjne prowadzenie ręcznej chromatografii kolumnowej, jest to, że automatyzacja procesu zmniejsza zmienność i zapewnia wysoką odtwarzalność wyników. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na złożoność konstrukcyjną nowoczesnych systemów chromatografii cieczowej. Można jednak szybko opanować obsługę tych urządzeń.

Po odpowiednim przeszkoleniu procedurę zademonstrują Orange Stone i Shelly Anderson, dwoje studentów z mojego laboratorium. Na początku należy przygotować 500 mililitrów następujących buforów: 200 milimolarny fosforan sodu jako bufor A1, 200 milimolarny wodorofosforan sodu jako bufor A2 oraz 4,8 molarny siarczan amonu jako bufor B2; woda dejonizowana będzie pełnić funkcję bufora B1. Bufory należy odgazować, aby zapewnić optymalne warunki pracy chromatograficznej. System Maximizer zmiesza bufory A1 i A2 w celu wytworzenia niskosolowego fosforanowego buforu elucyjnego, a także zmiesza bufory B1 i B2 w celu wytworzenia wysokosolowego buforu siarczanu amonu.

Bufor startowy. Przygotuj 20 mililitrów próbki do nałożenia, mieszając 10 mililitrów lizatu komórkowego zawierającego białko do oczyszczenia z 10 mililitrami buforu B dwa. Końcowe stężenie siarczanu amonu w roztworze próbki lizatu komórkowego powinno wynosić około 2,4 molar, co sprawi, że będzie on w przybliżeniu równoważny buforowi startowemu.

Przefiltruj mieszaninę buforu do lizy przez strzykawkowy filtr 0,45 µm o niskiej wiązalności białek, aby usunąć z roztworu zanieczyszczenia stałe. Przechowuj próbkę w lodzie do momentu wprowadzenia jej do systemu. Konfiguracja fizyczna i hydraulika systemu chromatograficznego stanowią jeden z najbardziej skomplikowanych etapów tej procedury.

Skonfiguruj system chromatografii duo flow zgodnie z przedstawionym tutaj schematem. Upewnij się, że dostępne są odpowiednie objętości buforu na cały protokół oraz że końcówki przewodów pozostaną zanurzone. Podłącz zawór załadunkowy próbki oraz dynamiczną pętlę próbki zgodnie z ilustracją, łącząc pętlę próbki z wlotem zaworu próbkowania w pozycji trzeciej.

Przygotować osiem par identycznie dociętych odcinków rurek PEEK o średnicy zewnętrznej 1/16 cala. Następnie połączyć pary te z pozycjami od jednej do ośmiu w dwóch zaworach wyboru kolumny. Po włączeniu lamp detektora UV i potwierdzeniu kalibracji wszystkich detektorów, podłączyć zawór rozdzielający strumień kolektora frakcji oraz kontroler rozdzielacza zgodnie z ilustracją.Tutaj.

Zawór rozdzielający i kontroler rozdzielający kolektora frakcji w pozycji drugiej są obsługiwane poza stacją roboczą do chromatografii. Ustaw procent podziału na 10. Zastąp standardową głowicę dozującą kolektora frakcji w pozycji drugiej głowicą do mikro płytek.

Przepłucz pętlę próbkową i oczyść system chromatograficzny. Następnie uruchom manualny przepływ buforu elucyjnego przez system z prędkością 1 ml/min. Podłącz kolumny HI trap o pojemności 1 ml do pozycji od drugiej do ósmej zaworów wyboru kolumn.

Zdemontuj złączkę łączącą zawory wyboru kolumn w pozycji drugiej. Podłącz złączki kolumny znajdujące się po stronie dopływu do duo flow. Przepuść bufor elucyjny przez złączki, aż do całkowitego usunięcia powietrza i pojawienia się dużej kropli buforu.

Następnie należy zdjąć korek z wlotu kolumny i nanieść dużą kroplę buforu o niskiej zawartości soli na górną część kolumny. Następnie podłączyć kolumnę do przyłączy doprowadzających. Wylot należy podłączyć do przyłączy kolumny odprowadzającej oraz do rurki zaworu wyboru.

Ustaw limit ciśnienia wstecznego na 40 PS.I. Przemyj kolumnę pięcioma objętościami kolumny buforu elucyjnego przy szybkości przepływu 1 ml/min. Przemyj kolumnę 10 objętościami kolumny buforu początkowego przy szybkości przepływu 1 ml/min.

Po ustabilizowaniu się zapisów pH i UV oraz ciśnienia wstecznego, ręcznie przełącz zawory wyboru kolumny w pozycję pierwszą i zatrzymaj przepływ buforu. Aby załadować próbkę, zanurz rurkę doprowadzającą próbkę w 20 mililitrach próbki. Następnie przełącz zawór płukania pętli załadunkowej próbki w pozycję pierwszą, a zawór załadunku próbki w pozycję purge.

Uruchom pompę załadowującą pętlę próbkową, zasysając próbkę do cewki pompy z przepływem 1 ml/min, aż do momentu, gdy próbka dotrze do zaworu załadowującego. Przełącz zawór załadowujący próbkę z pozycji płukania (purge) na pozycję ładowania (load). Ponownie uruchom pompę załadowującą pętlę próbkową z przepływem 1 ml/min, aż do momentu zassania 10 ml próbki do dynamicznej pętli próbkową z poziomu okna konfiguracji w oprogramowaniu biologicznym.

Wybierz urządzenia systemowe oznaczone gwiazdką w tej tabeli. Następnie wybierz sześć kolumn HIC do programu analizy. Liniowy malejący gradient soli oraz metoda rozpoznawcza dla sześciu kolumn ręcznie inicjują przepływ buforu startowego z prędkością 1 ml/min.

Naciśnij start na sterowniku rozdzielacza, aby rozpocząć rozdzielanie strumienia EIT w zakresie od 90% do 10%. Natychmiast po uruchomieniu metody programu naciśnij start na ekranie panelu sterowania offline'owego kolektora frakcji do płytek 96-dołkowych. Obserwuj wyświetlacz w czasie rzeczywistym, aby potwierdzić przewidywane parametry przebiegu. Porównaj przebieg absorbancji przy 397 nm specyficznej dla GFP z przebiegiem absorbancji przy 280 nm dla ogólnych białek, aby oszacować względne rozdzielenie i oczyszczanie przy użyciu różnych testowanych mediów HI. Alikwoty od 5 do 50 µL z frakcji na płytce 96-dołkowej można przenieść na nową płytkę i oznaczyć zawartość specyficznego białka metodą ELISA lub Western blot oraz całkowitą zawartość białek za pomocą SDS-PAGE lub mikrofluidycznego systemu elektroforezy Experian. Tutaj przedstawiono reprezentatywne wartości przewodności gradientu soli HI oraz ciśnienia kolumny z przebiegów wstępnych.

Zmiana stężenia soli, mierzona jako procent buforu pobieranego z linii buforów o wysokim zasoleniu, jest typowa dla metodologii HI. Wraz ze spadkiem stężenia soli białka związane z kolumną ulegają elucji, co odzwierciedla przewodność; stężenie soli jest mierzone w linii bezpośrednio za detektorami quad tech i UV. Przesunięcie między gradientem soli a zapisem przewodności wskazuje czas potrzebny na przemieszczenie się buforu od wlotu buforu przez system aż do monitora przewodności.

Przez cały czas trwania analizy próbki ciśnienie systemowe oraz pH pozostają na stosunkowo stałym poziomie. Rysunek ten przedstawia chromatogramy z sekwencyjnych przebiegów rozpoznawczych kolumny HI z detekcją całkowitego białka w układzie przepływowym. Wykrywanie NGFP odbywa się poprzez pomiar absorbancji światła odpowiednio przy 280 nanometrach i 397 nanometrach.

Możliwe jest przybliżenie względnej obfitości i separacji GFP dla każdego przebiegu rozpoznawczego. Poprzez porównanie dwóch linii na tej ilustracji, probówki z kulturami dla frakcji 10, 12, 14, 16 i 18 z przebiegu rozpoznawczego koperku FF zostały zwizualizowane w świetle otoczenia lub świetle fluorescencyjnym pomieszczenia oraz pod lampami ultrafioletowymi, patrząc zarówno od przodu, jak i z góry, aby zaobserwować charakterystyczne widmo emisji GFP; GFP jest wyraźnie wykrywane w frakcji 14. Na obu obrazach UV rozproszony niebieski kolor w lewym panelu UV to światło emitowane przez lampę UV.

Te dane uzyskane po zakończeniu procesu dobrze korelują z detekcją GFP w czasie rzeczywistym poprzez pomiar absorbancji eluatu przy 397 nanometrach, co również wskazuje, że frakcja 14 zawiera główny pik eluowanego GFP. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak western blotting, testy ELISA, mikroskopia sił atomowych oraz testy biochemicznej rekompozycji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące czystości i aktywności funkcjonalnej oczyszczanego białka.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o konieczności ręcznego sterowania systemem podwójnego przepływu w kilku punktach metody. Przykłady obejmują uzupełnianie buforu i wprowadzanie próbek, sprawdzanie obecności pęcherzyków powietrza oraz włączanie i wyłączanie lamp detekcyjnych w razie potrzeby. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania systemu chromatografii cieczowej do zautomatyzowanego poszukiwania optymalnych kolumn i wypełnień HI.

Analiza przeprowadzona na podstawie parametrów linii bazowej i posteru pozwoli badaczowi na wybór odpowiedniej kolumny do późniejszej puryfikacji w większej skali, którą można również połączyć z innymi metodami chromatograficznymi w celu zwiększenia czystości i wydajności białka docelowego.