Wychwytywanie limfocytów T CD4+ z wykorzystaniem jednorazowego chipa mikroprzepływowego w badaniach nad HIV

Witam, nazywam się Richard Lin i jestem badaczem w grupie profesora TI Mercy w dywizji nauk o zdrowiu i technologii Harvard MIT. Projekt, nad którym pracuję, polega na ilościowym określeniu i wychwytywaniu limfocytów T CD4+ oraz C3+ z krwi pacjentów do zastosowania w warunkach ograniczonych zasobów.

Bezpośrednio przede mną znajduje się urządzenie do mikroprzepływów wykonane z PDMS, czyli polidimetylosiloksanu. Wysokość samego kanału w urządzeniu wynosi 50 µm, a całkowita objętość urządzenia to 10 µL. Jest to niezwykle precyzyjne urządzenie, którego użyjemy do wychwytywania limfocytów T pomocniczych.

W zasadzie jest to standard diagnostyczny dla pacjentów z HIV. Powierzchnia urządzenia mikrofluidycznego została już przygotowana za pomocą białka, a w strzykawce znajdują się przeciwciała przeciwko CD4. Obecnie mamy jedynie bufor biologiczny PBS o pH 7.4, który teraz wprowadzimy do kanału, aby wypłukać nadmiar przeciwciał przeciwko CD4.

Na tym etapie nie ma potrzeby kontrolowania przepływu, ponieważ staramy się jedynie wypłukać nadmiar substancji i szybkość przepływu nie ma tutaj większego znaczenia. Tutaj znajdują się wloty urządzenia, a wyloty znajdują się po mojej lewej stronie i po Państwa prawej stronie. Teraz wypłukuję nadmiar roztworu przeciwciał; w wylocie widać wypływający płyn – jest to bardzo niewielka ilość, ale przy bliższym przyjrzeniu się można zauważyć, że płyn wypływa z kanału przez rurkę.

Po wypłukaniu nadmiaru roztworu przeciwciał możemy przygotować się do wprowadzenia krwi. Odłączę teraz cewkę z wlotu. Następnie otworzę nową strzykawkę z krwią ludzką, pełną krwią.

Zatem nie jest to próbka od pacjenta, lecz próbka od zdrowego ochotnika, którą przygotowujemy do wprowadzenia do urządzenia mikrofluidycznego. Teraz przymocujemy strzykawkę do pompy strzykawkowej. Po jej włączeniu można zobaczyć prędkość przepływu strzykawki, którą ustawiliśmy na 5 µL/min.

Teraz przygotujemy się do iniekcji do krwi. Umieścimy pompę strzykawkową pionowo, ponieważ jak wiemy, komórki krwi osiadają, a chcemy, aby komórki wpłynęły do kanału. Zatem lepiej jest, aby osad komórkowy gromadził się na dnie, czyli bezpośrednio przy naszej rurce.

Wszystko jest zatem przygotowane do rozpoczęcia pracy. Objętość mojego urządzenia wynosi 10 µL na 10 µL. Objętość, którą chcemy wprowadzić do ścianki kanału, również wynosi 10 µL.

Mogę zatem stwierdzić, czy wprowadziłem wystarczającą ilość krwi, patrząc jedynie na kolor kanału; jeśli jest on całkowicie wypełniony na czerwono, oznacza to, że wprowadziłem 10 µL i należy zatrzymać ogranicznik strzykawki. Teraz naciśnę przycisk startu i proces rozpocznie się – czasami krew dostaje się do kanału natychmiast, a czasami zajmuje to dłuższą chwilę. Jest to w dużej mierze związane z ciśnieniem.

Na przykład, po założeniu strzykawki, czasami należy odessać lub wstrzyknąć odpowiednią ilość płynu, aby dostosować poziom krwi w cewce. Może to zająć chwilę, ale gdy krew zacznie wpływać do kanału, przepływ zostanie ustawiony na ly na minutę, co jest wartością pożądaną. Należy zatem zachować cierpliwość i poczekać; niekiedy trzeba odczekać od dwóch do trzech minut, zanim krew zacznie wpływać do kanału.

W tej chwili można zauważyć, że krew zaczyna wpływać do kanału. Widać zatem, że urządzenie jest już prawie całkowicie wypełnione. Teraz przełączymy rurki z powrotem na PBS, aby wypłukać krew znajdującą się w kanale.

Aby to zrobić, powtórzymy czynności wykonane wcześniej w celu usunięcia rurek. Ponieważ nadal musimy kontrolować tempo przepływu PBS, wciąż potrzebujemy pompy strzykawkowej. Jednakże, ponieważ nie przepływa już krew, nie ma potrzeby pozostawiania pompy strzykawkowej w pozycji pionowej, gdyż w PBS nie ma komórek.

Wszystko jest już przygotowane, teraz wypłuczemy krew z urządzenia; ponownie naciśnę tutaj przycisk „sharp”. Jak widać, urządzenie zaczyna być oczyszczone. Na krawędziach wciąż znajduje się niewielka ilość krwi, ale powoli ona znika.

Gdy cała krew zostanie usunięta, zwiększymy szybkość przepływu z 5 µL/min do 20 µL/min. Powodem tej zmiany jest fakt, że we krwi znajdują się dwa typy komórek posiadające antygeny C4-dodatnie. Jednym z nich są poszukiwane przez nas limfocyty T pomocnicze.

Drugą grupą są komórki, które nazywamy monocytami. Chcemy mieć pewność, że nasze urządzenie wychwytuje specyficznie tylko limfocyty T pomocnicze, a nie jednocześnie limfocyty T pomocnicze i monocyty. Metodą, która pozwala nam to osiągnąć, jest zwiększenie szybkości przepływu, ponieważ wiemy, że monocyty są większe od komórek T pomocniczych.

Zatem poprzez zwiększenie szybkości przepływu, większe monocyty będą poddane silniejszemu naciskowi wymuszającemu opuszczenie powierzchni niż komórki T pomocnicze CD4+. Trwa to obecnie około 20 minut. W mojej dłoni znajduje się teraz roztwór.

Jest to roztwór lityzujący. Jego celem w tym przypadku jest liza erytrocytów. Wszędzie tam, gdzie w kanale pozostaną erytrocyty, roztwór ten doprowadzi do ich lizy.

Roztwór ten został rozcieńczony 10-krotnie z roztworu zapasowego. Teraz zatrzymamy pompę strzykawkową, zdejmiemy dren i zastąpimy aktualny roztwór roztworem z tej strzykawki. Zatrzymuję zatem urządzenie, zdejmuję dren, odłączam go i podłączam tę strzykawkę, zastępując poprzednią nową.

Dobrze, teraz gdy wszystko jest już przygotowane, zmniejszymy przepływ z powrotem do 5 µL/min. Zmieniamy wartość przepływu z 20 na 5 i teraz będziemy przepuszczać roztwór płuczący FACS przez 20 minut. Teraz naciskamy start.

Przed nami znajduje się obecnie obraz optyczny urządzenia wykonany przy 10-krotnym powiększeniu. Można dostrzec wszystkie te białe kropki. W jaki sposób możemy upewnić się, że są to właśnie te komórki, których szukamy?

Używamy kilku różnych barwników; pierwszym z nich jest tak zwany DAPI, który barwi jądra komórkowe. W związku z tym wszystkie komórki posiadające jądro, takie jak białe krwinki, zostaną zabarwione, natomiast krwinki czerwone, które nie mają jądra, nie ulegną zabarwieniu. Można to zauważyć na całym obrazie – widoczne są liczne niebieskie kropki, z których każda reprezentuje jądro komórkowe.

jest komórką. Kolejnym krokiem jest zatem sprawdzenie, czy komórki posiadają tzw. antygen C4-dodatni. Jest to niezwykle istotne, ponieważ głównym przeznaczeniem naszego urządzenia jest wychwytywanie komórek C4-dodatnich.

W następnym kroku stosujemy oczywiście przeciwciało fluorescencyjne specyficzne dla C4. Przejdźmy do następnego slajdu. Na tym obrazie komórki są znacznie słabiej widoczne, ponieważ przeciwciało fluorescencyjne, którego używamy, jest zazwyczaj rozcieńczone.

Zatem rozcieńczenie jest znacznie większe. Jednak przy uważniejszym przyjrzeniu się można nadal zauważyć kropki rozproszone w tym polu widzenia. Są one dość słabo widoczne.

Jednak po dokładniejszym zbadaniu możemy stwierdzić, że komórki te są dodatnie pod kątem CD4, co jest korzystne, ponieważ jest to dokładnie to, czego oczekujemy. Następny test, jak wspomniałem wcześniej, wynika z faktu, że istnieją dwa różne typy komórek CD4-dodatnich. Jednymi z nich są poszukiwane przez nas limfocyty T pomocnicze, a drugimi są komórki nazywane monocytami.

W związku z tym potrzebujemy kolejnego przeciwciała fluorescencyjnego, aby odróżnić oba typy komórek. Wiemy, że limfocyty T pomocnicze posiadają na swojej powierzchni antygeny określane jako CD3-dodatnie, podczas gdy monocyty ich nie mają.

Kolejnym zastosowanym przeciwciałem jest przeciwciało specyficzne dla CD3, co widzimy na tym obrazie. Ponownie można zauważyć, że kropki są rozproszone na urządzeniu; niektóre z nich wydają się większe, ponieważ niektóre komórki świecą jaśniej niż inne. Oznacza to, że w tym przypadku wiele elementów zależy od przypadku, ale w większości przypadków te jasnoczerwone kropki to komórki.

Zatem ponownie, naszym celem jest upewnienie się, że komórki są CD4 pozytywne oraz CD3 pozytywne. W tym przypadku widać, że wiele naszych komórek jest CD3 pozytywnych, co jest korzystne, ponieważ zapewnia nam to specyficzność podczas wychwytu.

Te duże kropki mogą być zanieczyszczeniami, jednak często zdarza się, że komórka po prostu zgromadziła na swojej powierzchni więcej przeciwciał anty-CD3. Na tym zdjęciu widać jeden z zestawów danych, które zebraliśmy za pomocą tego urządzenia mikroprzepływowego, które w zasadzie służy do wychwytywania komórek. Na poprzednich slajdach można było zauważyć wiele zdjęć z widocznymi na nich komórkami.

Ale do czego właściwie prowadzi ta akumulacja? Pozwala ona stworzyć profil wychwytu komórek, w którym na osi X wykreślamy odległość od wlotu, a na osi Y liczbę wychwyconych komórek. Widać, że w całym urządzeniu gęstość komórek jest początkowo niezwykle wysoka, a następnie powoli spada, co jest zgodne z naszymi oczekiwaniami, ponieważ wychwytujemy z krwiobiegu komórki C4-dodatnie i C3-dodatnie, a ich stężenie w próbce krwi ulega stopniowemu zmniejszeniu.

I w ten sposób zazwyczaj prezentowane są nasze dane.