Analiza oddziaływań gospodarz-wirus podczas litycznej replikacji modelowego herpeswirusa

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykorzystanie różnych podejść wirologicznych i biochemicznych do przeanalizowania roli szlaku sygnalizacyjnego gospodarza w litycznej replikacji modelowego wirusa opryszczki. Jako przykład badamy tutaj rolę mitochondrialnego białka sygnalizacji przeciwwirusowej Mavs podczas infekcji wirusem opryszczki gamma HV 68. W celu zbadania roli Mavs podczas ostrej infekcji, myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem genu Mavs zostają zainfekowane gamma HV 68 w ramach ostrej infekcji wirusowej.

Pobiera się płuca myszy, a następnie wyznacza miano wirusa za pomocą testu plackowego, w którym próbki są rozcieńczane seryjnie i wysiewane. Następnie na monowarstwach zlicza się liczbę placków. Zwiększone miano wirusa u myszy z knockoutem sugeruje, że badany gen pełni rolę przeciwwirusową.

W przeciwieństwie do tego, zmniejszona wiremia u myszy z knockoutem wskazuje, że gen ten jest niezbędny do infekcji wirusowej. Aby zweryfikować te wyniki, badano kinetykę wieloetapowego wzrostu wirusa in vitro w zarodkowych fibroblastach mysich; zarodkowe fibroblasty mysie typu dzikiego oraz zarodkowe fibroblasty mysie z knockoutem mavs zainfekowano wirusem gamma HV 68 i inkubowano przez różne odstępy czasu. Następnie zebrano komórki i przeprowadzono testy płytkowe, aby porównać kinetykę wieloetapowego wzrostu między komórkami typu dzikiego a komórkami z niedoborem mavs.

Aby dodatkowo zweryfikować te wyniki, zarazem embrionalne fibroblasty mysie typu dzikiego oraz z knockoutem genu mavs są infekowane wirusem gamma HV 68. Następnie z zainfekowanych komórek oddzielnie ekstrahuje się DNA i RNA, a transkrypty genomowe wirusa analizuje się za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Pomysł na ten protokół pojawił się podczas badania roli szlaku odporności gospodarza podczas litycznej infekcji wirusowej.

Niniejszy protokół może potencjalnie zostać zastosowany do badania reguł sygnałowych szlaków gospodarza podczas infekcji innymi patogenami. Przed rozpoczęciem procedury należy pozwolić myszom w wieku od sześciu do ośmiu tygodni, dobranym pod względem płci i pochodzącym z jednego miotu, na aklimatyzację przez okres czterech dni po transporcie. Poniższy eksperyment zostanie przeprowadzony w obiekcie przeznaczonym do pracy z materiałem biologicznym niebezpiecznym.

W ramach przygotowań należy założyć środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny, rękawiczki, maskę oraz ochraniacze na obuwie, pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu drugiego. Przygotować zawiesinę wirusową zawierającą od 40 do 10 000 PFU gamma HV 68 oraz 30 µL sterylnego PBS dla każdej myszy, która zostanie zainfekowana.

Przechowywać zawiesinę wirusową w lodu po podaniu dostronikowym ketaminy i ksylazyny. Upewnić się, że myszy zostały uspokojone, wykonując próbę uszczypnięcia palca. Następnie, używając pipety, wprowadzić 30 µL zawiesiny wirusowej kroplami do lewej lub prawej dziurki nosa.

Połóż mysz na boku na pięć do 10 minut, aby ułatwić dostarczenie wirusa do płuc drogą oddechową. Następnie umieść myszy z powrotem w klatce i monitoruj je, aż całkowicie wybudzą się z sedacji. Następnie od pobranych myszy pobiera się tkankę płucną w celu przygotowania lizatu komórkowego do oceny miana wirusa w różnych dniach po infekcji.

Umieścić płuca pobrane od uśpionych myszy w sterylnych probówkach z nakrętką o pojemności 1,5 ml zawierających 500 µL kulek cyrkonowo-krzemionkowych o średnicy 1,0 mm, a następnie przenieść na lód. Jeśli następny krok nie zostanie wykonany tego samego dnia, próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

W przeciwnym razie należy dodać 1 mL zimnej pożywki DMEM bez surowicy. Umieść probówkę w homogenizatorze kulkowym i naciśnij start, aby homogenizować płuca przez 30 s. Pozwoli to uniknąć przegrzania próbki, co mogłoby doprowadzić do inaktywacji wirusa.

Schładzaj probówkę na lodzie przez co najmniej jedną minutę po 30 sekundach homogenizacji. Następnie powtórz ten proces. W dalszej kolejności odwiruj zhomogenizowaną tkankę przy 16 000 RCF w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę.

Po wirowaniu szczątki komórkowe znajdą się na dnie probówki, a lipidy na powierzchni. Należy niezwłocznie pobrać supernatant, jak pokazano tutaj, aby przeprowadzić test plackowy z wykorzystaniem monowarstwy komórek NIH 3T3 lub BHK-21. Następnie wykonuje się test plackowy w celu oznaczenia miana wirusa w próbce; należy rozpocząć go od przygotowania rozcieńczeń seryjnych supernatantu wirusowego.

W pierwszej kolejności za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 270 µL pożywki do płytki 96-dołkowej. Pozostaw pierwszy rząd pusty. Następnie dodaj 200 µL supernatantu do pierwszego rzędu płytki 96-dołkowej, nanosząc każdą próbkę w trzech powtórzeniach.

Następnie przenieś 30 µL próbki z pierwszego rzędu do następnego rzędu i wymieszaj. Następnie przenieś 30 µL mieszaniny do kolejnego rzędu i wymieszaj. Powtórz ten krok wielokrotnie, aby przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne.

Następnie nanieś rozcieńczony nadsącz wirusowy na monowarstwę komórkową w płytce 24-dołkowej. Umieść płytkę w inkubatorze i wstrząsaj nią co 30 minut podczas dwugodzinnej inkubacji. Po zakończeniu inkubacji odessaj nadsącz z płytki, aby usunąć szczątki komórkowe.

Następnie raz przemyj komórki świeżą pożywką. Po przemyciu dodaj do komórek pożywkę zawierającą metylocelulozę. Inkubuj komórki przez cztery do sześciu dni.

Po upływie od czterech do sześciu dni należy za pomocą mikroskopu odczytać liczbę plak dla każdej próbki. Zapisz liczbę plak dla każdego rozcieńczenia.

Następnie oblicz średnią oraz odchylenie standardowe. Do dokładnego obliczenia miana nie można wykorzystać dołków zawierających zbyt wiele lub zbyt mało plak. W związku z tym dla każdej próbki należy wybrać takie rozcieńczenie, w którym znajduje się od 7 do 70 plak.

Próbka ta, rozcieńczona 1000-krotnie, zawiera średnio 23 plaki na dołek. Aby obliczyć miano wirusa w nierozcieńczonym roztworze, należy pomnożyć współczynnik rozcieńczenia przez liczbę plaków oraz liczbę mikrolitrów w jednym mililitrze. Następnie wynik ten należy podzielić przez objętość rozcieńczonego nadosadu dodaną do każdego dołka.

W tym przykładzie: 1000 razy 23 plakówki razy 1000 µL na ml podzielone przez 100 µL równa się 2,3 × 10⁵ jednostek tworzących kolonie na ml. Następnie roztwór zapasu wirusa o znanym mianie jest wykorzystywany do wyznaczenia kinetyki wzrostu gamma HV 68 w embrionalnych fibroblastach mysich. Procedurę rozpoczyna się od wysiania mysich fibroblastów typu dzikiego oraz tych z deficytem określonego genu gospodarza na płytkę 24-dołkową w zagęszczeniu 10 000 komórek na dołek. Następnego dnia medium w każdym dołku należy zastąpić 0,5 ml zawiesiny gamma HV 68 o niskim MOI.

Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i inkubuj przez dwie godziny. Co 30 minut w trakcie inkubacji delikatnie potrząśnij płytką. Za pomocą pipety usuń zawiesinę wirusa, a następnie dodaj 0,5 ml świeżego, kompletnego medium DMEM zawierającego 8% płodowej surowicy bydlęcej do zainfekowanych wirusem komórek.

Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze w określonych dniach po infekcji. Zebrać medium i komórki, pipetując wielokrotnie w górę i w dół. Przenieść je do sterylnych probówek do wirowania o pojemności 1,5 milliliter, a następnie natychmiast zamrozić probówki w temperaturze minus 80 degrees Celsius, aby uwolnić gamma HV 68 z komórek.

Przeprowadź trzy cykle zamrażania i rozmrażania. Rozmroź komórki, umieszczając je w temperaturze 37°C. Następnie wymieszaj je w wortexie i ponownie umieść w zamrażarce w temperaturze -80°C.

Wyznacz miano wirusa za pomocą metody plackowej, wykorzystując monowarstwę komórek NIH 3T3 lub BHK 21 zgodnie z wcześniejszym opisem, aby zbadać, czy replikacja DNA lub RNA jest zaburzona przez deficyt genów gospodarza lub genów wirusowych. Rozpocznij od zainfekowanych komórek w różnych dniach po infekcji, odlej supernatant, wypłucz komórki zimnym PBS i zneutralizuj je trypsyną w lodzie. Następniet osadź komórki poprzez wirowanie przy 1000 RCF w temperaturze pokojowej przez jedną minutę; po wirowaniu odlej supernatant i przechowuj komórki w temperaturze -80 °C.

Wyekstrahuć całkowite DNA i RNA pochodzenia gospodarza oraz wirusa. Następnie odwiruj kolumny do oczyszczania. Przeprowadź reakcję real-time PCR z wykorzystaniem całkowitego DNA oraz starterów specyficznych dla litycznych transkrypty wirusowych.

Wyznacz względną ilość wewnątrzkomórkowego genomu gamma HV 68 w odniesieniu do genu gospodarza odpowiedzialnego za podstawowe funkcje komórkowe, takiego jak beta aktyna. Przygotuj cDNA z całkowitego RNA i startera oligo DT. Przeprowadź reakcję real-time PCR z wykorzystaniem cDNA oraz starterów opisanych powyżej, aby określić względną ilość transkrypcyjnych produktów wirusa.

W odniesieniu do genu gospodarza odpowiedzialnego za homeostazę, Mavs jest skrótem od mitochondrial antiviral signaling, co przedstawiono tutaj. Cząsteczka adapterowa Mavs przekazuje sygnały z cytozolowych receptorów podobnych do RIG, aby aktywować NF kappa B oraz czynniki regulacyjne interferonu (IRFs), które z kolei zwiększają ekspresję genów cytokin prozapalnych i interferonów. Przedstawiono tutaj ładunek wirusowy w płucach myszy typu dzikiego oraz myszy z jednego miotu z niedoborem Mavs, zainfekowanych gamma HV.

Niedobór Mavs znacząco zmniejszył ładunek wirusa w płucach 10 dni po zakażeniu, co wskazuje, że Mavs jest niezbędny do efektywnego zakażenia wirusem in vivo. Rysunek ten przedstawia wieloetapową krzywą wzrostu wirusa na embrionalnych fibroblastach mysich typu dzikiego oraz tych z niedoborem Mavs. Znaczące opóźnienie wzrostu wirusa na embrionalnych fibroblastach mysich wskazuje, że Mavs jest wymagany do efektywnej replikacji wirusa in vitro. Poziomy mRNA litycznych genów wirusowych w embrionalnych fibroblastach mysich zainfekowanych gamma HV 68 przeanalizowano za pomocą PCR w czasie rzeczywistym; niedobór Mavs znacząco obniżył poziomy mRNA trzech kluczowych genów litycznych.

Wszystkie te wyniki wspólnie potwierdzają wniosek, że Mavs jest niezbędny do aktywacji transkrypcji gamma HV 68 oraz replikacji litycznej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre zrozumienie tego, jak badać interakcje między patogenem a gospodarzem na wielu poziomach, zarówno w VO, jak i w Vevo. Pamiętaj, że praca z patogenami może być niezwykle ryzykowna.

Podczas przeprowadzania procedur należy zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie środków ochrony osobistej.