Ilościowe oznaczenie i analiza powstawania translokacji chromosomowych indukowanych przez endonukleazę HO poprzez odżarzanie pojedynczych nici w Saccharomyces cerevisiae

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie kontroli genetycznej tworzenia translokacji poprzez kneeling jednoniciowy w diploidalnych komórkach drożdży pączkujących. Jest to realizowane poprzez wstępne zaszczepienie kultur pojedynczymi koloniami o konkretnym genotypie i ich nocną inkubację. Drugim krokiem procedury jest indukowanie jednoczesnego powstania pęknięć dwuniciowych przez endonukleazę ho na dwóch chromosomach poprzez dodanie galaktozy do kultur.

Kolejne rozcieńczenia tych kultur wysiewa się na podłoża selektywne i nieselektywne. Ostatnim krokiem jest wyznaczenie częstości translokacji poprzez zliczenie kolonii powstałych na podłożach selektywnych i nieselektywnych. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące genetyczną kontrolę powstawania translokacji przez pojedynczą nić, poprzez analizę zmian w częstości stymulowanego powstawania translokacji w szczepach o różnych genotypach.

Znaczenie tej techniki rozciąga się na konsekwencje terapejnego naświetlania pacjentów z nowotworami, ponieważ pęknięcia obu nici DNA oraz powstawanie translokacji są głównymi skutkami takiego leczenia. Aby rozpocząć procedurę wyznaczania częstotliwości translokacji indukowanych przez enzym ho, zaszczepić od 10 do 20 niezależnych kultur o objętości jeden mililitr w podłożu glicerolowo-mleczanowym Y peak pojedynczymi koloniami o pożądanym genotypie, a następnie inkubować kultury przez noc w temperaturze 30 °C na rotatorze. Gdy kultury osiągną pożądaną gęstość komórkową, dodać do nich 20% galaktozy do stężenia końcowego 2%. Galaktoza indukuje ekspresję endonukleazy ho, która spowoduje pęknięcia obu nici w allelu his3-Δ5' na chromosomie 3 oraz allelu his3-Δ3' na chromosomie 15. Inkubować przez cztery godziny w temperaturze 30 °C na rotatorze.

Kolejny krok jest kluczowy dla powodzenia procedury. Niezbędne jest staranne rozcieńczenie i wysianie kultur. Aby uzyskać częstotliwości translokacji wystarczająco powtarzalne, by umożliwić statystycznie istotne porównania między szczepami o różnym genotypie, po czterech godzinach należy wysiać odpowiednie rozcieńczenia kultur na podłoże pozbawione histydyny oraz na podłoże YPD. W celu uzyskania około 100 do 200 kolonii na płytkę, inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez dwa do trzech dni.

Po pojawieniu się kolonii można określić częstotliwość translokacji. Efektywność wysiewu przed i po indukcji ekspresji endonukleazy ho wskaże, czy obecność lub brak któregokolwiek z chromosomów translokacyjnych wpływa na zdolność przeżycia po powstaniu DSB. Fragmentuje jedną kopię zarówno chromosomu trzy, jak i chromosomu 15, aby określić efektywność wysiewu przed indukcją.

W pierwszej kolejności należy pobrać alikwot komórek z każdej kultury inkubowanej przez noc i określić liczbę komórek, wykonując odczyt za pomocą cytometru hematologicznego. Następnie, stosując odpowiednie rozcieńczenie, należy wysiać około 100 do 200 komórek na podłoże YPD i inkubować przez dwa do trzech dni w temperaturze 30 °C aż do pojawienia się kolonii. Do pozostałych kultur należy dodać 20% galaktozy do stężenia końcowego 2% i inkubować w temperaturze 30 °C przez cztery godziny, aby określić wydajność wysiewu po indukcji.

Po czterech godzinach indukcji pobierz alikwot komórek z każdej hodowli i określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Wysiej odpowiednie rozcieńczenie w celu przeliczenia około 100 do 200 komórek na podłoże YPD; inkubuj przez dwa do trzech dni w temperaturze 30 °C aż do pojawienia się kolonii. Po wystąpieniu kolonii na płytkach można określić wydajność wysiewu. Domniemane klony z translokacją można przebadać metodą southern blot.

W tej procedurze wykorzystuje się DNA genomiczne przygotowane z pojedynczej kolonii rekombinacyjnej HIS+ z każdej niezależnej próby. Każdą próbkę DNA o masie około 4 µg trawiono restryktazą BAM H I. Fragmenty po trawieniu BAM H I rozdzielano w żelu agarozowym 0,7%, a następnie przenoszono na dodatnio naładowaną membranę nylonową i hybrydyzowano z sondą znakowaną P 32, otrzymaną metodą random priming z wykorzystaniem klonu genomicznego BAM H I o wielkości 1,8 kb zawierającego gen HIS3. Fragmenty DNA wizualizowano za pomocą autoradiografii lub obrazowania fosforycznego. Inną metodą badania potencjalnych klonów z translokacją jest analiza wykresu chromosomowego.

W pierwszej kolejności chromosomy preparuje się z wybranych rekombinantów hiss plus w próbkach typu plug aros; oddziela się chromosomy na żelu aros 1% w homogenicznym polu elektrycznym o zmiennej konfiguracji (CHEF) w temperaturze 14°C. Stosuje się następujące parametry: pierwszy blok 14°C, czas przełączania 72 s i 15 godzin przy 6 V/cm, drugi blok 14°C, czas przełączania 122 s i 11 godzin przy 6 V/cm. Po zakończeniu elektroforezy chromosomy wizualizuje się poprzez barwienie żelu bromkiem etydium przez 30 minut, a następnie naświetlanie promieniowaniem UV i odbarwianie w wodzie destylowanej; chromosomy przenosi się na membranę naładowaną dodatnio metodą kapilarną.

W warunkach denaturujących przeprowadza się hybrydyzację z sondą znakowaną P 32, uzyskaną metodą random priming z 1,8 kilobazy klonu genomicznego Bam H I Bam H I zawierającego gen HIS3. Chromosomy wizualizuje się za pomocą autoradiografii lub obrazowania fosforowego. Częstość translokacji chromosomalnych można obliczyć, dzieląc liczbę kolonii histydynowo-troficznych przez całkowitą liczbę żywych komórek, określoną poprzez wysiew na podłoże YPD.

W tym przykładzie obliczona częstość rekombinacji wynosi około 3%. Analizę częstości translokacji stymulowanych przez ho można przeprowadzić z użyciem szczepów o różnych genotypach, aby porównać różnice w zdolności do naprawy pęknięć dwuniciowych poprzez odbliznowienie, jak pokazano na tym reprezentatywnym wykresie. Częstości translokacji uzyskane zarówno selektywnie, jak i nieselektywnie u homozygoty RAD 51 delta null były statystycznie różne od tych uzyskanych w odpowiadających warunkach u szczepu typu dzikiego, zarówno przed, jak i po wysiewie indukcyjnym.

Wydajność określa się poprzez podzielenie całkowitej liczby żywotnych komórek tworzących kolonie przez całkowitą liczbę ciał komórkowych w hodowli, wyznaczoną za pomocą licznika komórek (hemocytometru), jak pokazano w tej tabeli przed i po wysiewaniu indukowanym. Wydajność nie różniła się znacząco w przypadku komórek typu dzikiego, co sugeruje, że obecność lub brak dowolnego chromosomu z translokacją nie wpływa na zdolność do przeżycia po powstaniu DSB.

Domniemane klony niosące translokację można zbadać za pomocą genomowej analizy Southern blot. Przedstawiono tutaj graficzną reprezentację odpowiednich chromosomów przed i po powstaniu translokacji. Wielkości fragmentów restrykcyjnych zawierających odpowiednie sekwencje, wygenerowanych przez trawienie BamH1 DNA genomowego szczepów rodzicielskich i rekombinantów i ujawnionych na blotach poprzez hybrydyzację z 1,8 kb sondą BamH1.

Trzy klony genomowe genu HIS3 zostały przedstawione w parach kilobaz dla analizy Southern blot. Genomowe DNA trawione jest endonukleazą BMH1 i hybrydyzowane z probem HIS3 o długości 1,8 kilobazy, znakowanym P 32, w celu wizualizacji tych fragmentów diagnostycznych.

Fragmenty 0.8 kilobazy HIS3 Δ20, 1.7 kilobazy HIS3 Δ3', 4 kilobazy T315, 5 kilobazy T153 oraz 8 kilobazy HIS3 Δ5'. Ścieżka A to diploid rodzicielski. Ścieżka B to rekombinant z nie wzajemną translokacją his+, a ścieżka C to wzajemna translokacja his+.

Analiza rekombinowanego BLO chromosomowego może być również wykorzystana do badania klonów z translokacjami. Nieuszkodzone chromosomy przygotowane w próbkach typu aros są rozdzielane za pomocą elektroforezy chef, a żel barwiony bromkiem irydu i wizualizowany w świetle UV. Rozdzielone chromosomy są następnie przenoszone na membranę nylonową i hybrydyzowane z sondą o długości 1,8 kilobazy znakowaną P 32.

Trzy sondy do wizualizacji nienaruszonego chromosomu 1.1 megabase, chromosomu z translokacją T 15 three o wielkości 15.8 megabase, chromosomu z translokacją T three 15 o wielkości 0.6 megabase oraz nienaruszonego chromosomu three o wielkości 0.3 megabase. Ścieżka A to szczep rodzicielski. Ścieżka B to rekombinant z nie-wzajemną translokacją his+, a ścieżka C to rekombinant z wzajemną translokacją his+.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, w jaki sposób określić częstotliwość powstawania translokacji po wielokrotnych pęknięciach dwuniciowych indukowanych przez HO.