Tytuł: Enkapsulacja komórek w kropelkach

Nazywam się Hang Moon. Współpracuję z profesorem specjalizującym się w badaniach nad kondomami. Razem pracujemy z platformą XYJ, aby stworzyć strukturę 3D komórki.

Witajcie, jestem PE oraz Lynn i pracuję nad projektem drukowania komórek z wykorzystaniem enkapsulacji komórek, mediów i żeli. Jest to zawór elektromagnetyczny służący do wyrzutu mieszaniny komórek i hydrożeli do medium hodowlanego. Zawór elektromagnetyczny jest aktywowany za pomocą dwóch linii sygnałowych.

Linia sygnałowa pochodzi stąd, z płytki stykowej. Sygnał pochodzi z tego miejsca. Ta linia, przechodząca przez tę linię, to pierwszy generator funkcji.

Najpierw jest on generowany w sposób zaprogramowany. Jeśli zatem chcą Państwo zmienić impuls, można zmodyfikować program w linii przełączników lub sterować generatorem procesu za pomocą komputera. Zawór komórkowy jest otwierany i zamykany za pomocą sygnału elektrycznego, natomiast dopływ do komórki odbywa się poprzez tę linię.

Komórki oraz pożywka lub żel agro są podawane za pomocą strzykawek. Strzykawki znajdują się w wodzie, a tłok wewnątrz strzykawki jest dociskany przez powietrze. Sprężone powietrze jest dostarczane ze zbiornika, zgodnie z przebiegiem linii.

Zatem cienka linia i zjonizowane powietrze przepływają przez filtr powietrza. Filtr powietrza oddziela kurz i inne rodzaje zanieczyszczeń. Generator ciśnienia, tak go nazywamy, generuje sygnał służący do otwierania lub zamykania zaworu powietrznego ogniwa słonecznego; komputer jest z nim połączony za pomocą złącza P-I-B-U-S-V.

Możemy skorzystać z portu USB, podłączając go bezpośrednio do naszego komputera, laptopa. Jest on podłączony z tej strony. Następnie możemy sterować urządzeniem za pomocą tego laptopa sterującego.

Zatem w celu synchronizacji ruchu stolika oraz otwierania dzwonu, oba te elementy mogą być sterowane za pomocą tego samego kontrolera, jakim jest laptop. Pozwala to na kontrolowanie czasu otwierania, zamykania, rozpoczynania oraz zatrzymywania ruchu. Dzięki temu możemy zsynchronizować przemieszczanie się stolika z otwieraniem dzwonu.

Jest to stolik z napędem mechanicznym. Jest on automatycznie przemieszczany za pomocą linii sygnałowej i silnika. Rozdzielczość motoryzacji wynosi 0,1 µm.

W idealnych warunkach może on wyrysować linię o długości do 100 mm. Oś dyszy porusza się zatem w górę i w dół, co pozwala kontrolować przerwę między podłożem a pasmem solnym.

Dzięki temu można kontrolować wysokość wyrzutu. Podłoże jest połączone z tutejszymi stolikami XY, tutaj w osi X i tam w osi Y. W związku z tym porusza się ono w płaszczyźnie XY.

W ten sposób rysuje pewne elementy demonstracyjne; odpowiednie etapy to 3X, X, Y oraz G. Oś dyszy, czyli oś XY, jest sterowana przez sygnał w tym miejscu. Linia sygnałowa jest podłączona do tutejszego kontrolera ruchu. Ten kontroler ruchu nie posiada żadnego przełącznika ręcznego, ponieważ nie może być sterowany manualnie.

Sterowanie odbywa się za pomocą laptopa. Laptop jest podłączony. Z tyłu kontrolera znajdują się trzy wejścia xs dla komórki drukującej XY jet.

W ten sposób generowane są niezależnie trzy różne rodzaje sygnałów. Następnie sterownik ruchu komunikuje się poprzez złącza RF 2, 3, 2, które są bezpośrednio połączone z USV, a USV jest podłączony do komputera przenośnego.

Zatem sterownik kontrolowany przez laptop. Używamy programu AutoCAD, tworzymy ścieżkę G-code w ten sposób i bam. Następnie zostaje ona przekształcona na język maszynowy w ten sposób.

W ten sposób język maszynowy jest przekazywany w formie prostych znaków i liczb. Każda pozycja odpowiada tutaj etapom X, Y i Z. Wybieram plik zawierający tego rodzaju program, a następnie otwieram program pobierania w ten sposób. Następnie z pliku wybieram dokładnie to samo, czyli plik tekstowy.

Pobieramy tylko plik tekstowy; należy wybrać plik tekstowy, a następnie automatycznie pobrać go z laptopa do kontrolera ruchu Com Motion Executive, a potem uruchomić go za pomocą funkcji BAM, o której wspomniałem wcześniej. W tej kolbie znajdują się komórki fibroblastów mysich NIH 3T3. W pierwszej kolejności odessam stare medium.

Niniejszy proces służy do pasażowania komórek, które przylegają do dna kolby. Po odessaniu pożywki dodaję 6 µL trypsyny, która jest enzymem. Po wprowadzeniu trypsyny do kolby należy odczekać od trzech do pięciu minut, aż komórki odłączą się od dna kolby.

Teraz jesteśmy gotowi do dodania pożywki i przeniesienia komórek do probówki do wirowania. Jest to rozcieńczenie w stosunku jeden do jednego. Dodaję zatem 6 ml tej pożywki i lekko wypłukuję osad, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały przeniesione.

Komórki są już gotowe do wirowania w tej probówce. Teraz będziemy wirować te komórki przy 1000 RPM przez 3–5 minut. Po odwirowaniu komórek do postaci osadu, odessam nadsącz.

Teraz wypłukam komórki za pomocą PBS. Służy to do barwienia komórek. Jako barwniki wykorzystujemy substraty esterazy.

Teraz ponownie odwirujemy próbkę, aby osadzić komórki w formie pelletu. Odessam PBS, a następnie zawieszę komórki w pożywce w celu ich policzenia.

Mieszam komórki, aby po pobraniu próbki ich stężenie było jednolite w całej probówce. Teraz pobiorę 100 µL zawiesiny komórek w celu zmierzenia gęstości komórek. Następnie dodaję 100 µL trypan błękitu, który jest barwnikiem.

Odczekamy od trzech do pięciu minut, aby barwnik mógł przeniknąć przez błony martwych komórek. Podczas zliczania nie uwzględniamy komórek zabarwionych na niebiesko. Komórki są gotowe do zliczenia przy użyciu cytometru hematologicznego; przeniosę 50 µL mieszaniny komórek na każdą stronę cytometru hematologicznego.

Dobrze, teraz przykryję to szkiełkiem przedmiotowym. Hemocytometr ma dwie komory. Policzę najpierw pierwszą stronę, a po policzeniu obu stron wyciągnę średnią i pomnożę ją przez dwa, ponieważ zastosowaliśmy rozcieńczenie jeden do jednego z barwnikiem w kolorze niebieskim.

Zatem gęstość naszych komórek wyniesie 135 × 10⁴ komórek/ml. W naszym doświadczeniu będziemy używać zawiesiny komórkowej o stężeniu 0,5 miliona komórek/ml. Ponieważ mamy 13,5 miliona komórek, resuspenduję je w 27 ml pożywki.

Używamy dwóch różnych rodzajów barwników. Jest to test żywotności komórek (live dead assay) firmy Molecular Probes. Pierwszy barwnik to calcium am.

Naszym drugim barwnikiem jest homodimer AUM. Barwi on martwe komórki. Wykorzystujemy wzbudzanie niebieskie w celu uzyskania zielonej fluorescencji oraz wzbudzanie zielone w celu uzyskania czerwonej fluorescencji. W przypadku tych dwóch barwników, podczas obrazowania, nasz roztwór będzie przygotowany w PBS.

Najpierw przeniosę 5 mL PBS (fosforanowo-buforowanej soli fizjologicznej) do probówki. Jest to roztwór soli. Teraz dodam 0,5 µL calcium am per mil.

Teraz dodaję do probówki 2,5 µL calcium am oraz 2 µL athe homodimer na 1 mL PBS. Oto urządzenie btex. Zapewnia ono równomierne rozłożenie komórek i medium w całej objętości.

Teraz pobieramy 200 µL komórek do tej strzykawki. Następnie nakładamy zatyczkę, aby szczelnie zamknąć układ w ten sposób. Otwieram zawór, dzięki czemu dopływa powietrze pod ciśnieniem, a następnie reguluję pasek w ten sposób. To zmienia ciśnienie.

Dostosowuję zatem ustawienia. Ciśnienie wynosi 5 PSI. Ciśnienie wewnątrz rurki wynosi 5 PSI.

Z tego miejsca do tego połączenie odbywało się poprzez ten element wewnątrz otworu. Otwieramy tutaj dzwonek, następnie komórka zostaje poddana ciśnieniu 5 PSI i zaczyna się otwierać. Wówczas zaczyna działać zawór Sona.

Następnie przesuwamy podłoże. Podłożem jest zwykłe szkiełko przedmiotowe. Następnie nakładamy odpowiednią porcję materiału i mocuję podłoże za pomocą taśmy klejącej w ten sposób, zgadza się?

Następnie po prostu go mocuję. Ustawiamy cały układ: komórkę, zawór ary oraz podłoże, a następnie uruchamiamy pracę ary. Po przygotowaniu całego zestawu otwieramy zawór ary i rozpoczynamśmy pracę.

Następnie przesuwamy stolik w ten sposób, prawda? Potem tworzymy na podłożu pewien wzór i gotowe. Teraz zanurzę te wydrukowane krople w przygotowanym wcześniej roztworze barwnika.

Krople zostaną teraz inkubowane przez 10 minut, a następnie poddane obrazowaniu. Najpierw dostroję obraz przez okular. Pierwszy obraz to zwykły obraz w jasnym polu.

Wyłączę światło i zmienię filtr na taki, który zapewni niebieskie wzbudzenie, co pozwoli uwidocznić zieloną fluorescencję. Trzecie zdjęcie, które wykonamy, przedstawi martwe komórki, przy użyciu barwienia Thm Homodimer. Przy zastosowaniu zielonego światła uzyskamy czerwoną fluorescencję.