Przygotowanie synaptoneurosomów z kory mózgu myszy z wykorzystaniem nieciągłego gradientu gęstości Percoll-sukroza
17 września 2011
Opisano metodę przygotowania translacyjnie aktywnych, nienaruszonych synaptoneurosomów (SNs) z kory mózgu myszy. Metoda ta wykorzystuje nieciągły gradient gęstości Percoll-sukroza, co umożliwia szybkie przygotowanie aktywnych SNs.
Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie translacyjnie aktywnych stref synaptonemymalnych z kory mózgu myszy, z wykorzystaniem nieciągłego gradientu gęstości sacharozy. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie i homogenizację kory mózgu myszy, a następnie wirowanie homogenatu. Następnie homogenat z wirowania, czyli nadsącz, nanosi się na przygotowane gradienty sacharozy.
Ostatnim krokiem jest wirowanie i zebranie frakcji synaptosomów. Ostatecznie analiza western blot oraz eksperymenty z wbudowywaniem S 35 metioniny wykazują, że frakcja synaptosomów jest wzbogacona w komponenty synaptyczne i aktywna translacyjnie. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wirowanie i filtracja, są po pierwsze uniknięcie uszkodzeń mechanicznych dzięki zastosowaniu gradientów gęstości, a po drugie niska toksyczność percoll dla komórek i ich składników.
Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności w realizacji protokołu, ponieważ kluczową rolę odgrywa w nim czas. Po zebraniu kory procedura powinna zostać szybko ukończona. Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować warstwy gradientu 3, 10, 15 i 23%, dodając do buforu GM odpowiednie ilości SIP zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie, a następnie dokładnie wymieszać.
Przygotuj warstwy gradientu, pipetując po dwa mililitry z każdego z trzech izoosmotycznych roztworów Percoll o stężeniach 15%, 10% i 3% do zakręcanych probówek do wirówki Beckman. Używając pipety P 1000, należy dbać o to, aby granica między warstwami była wyraźnie widoczna i aby nie doszło do ich wymieszania. Przechowuj gradienty w temperaturze czterech stopni Celsius przez co najmniej 20 minut przed użyciem.
Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować pozostałe niezbędne roztwory zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie. Myszy w wieku od P 13 do P 21 należy uśmiercić i przygotować do sekcji, spryskując kark i głowę 70% ethanol. Następnie za pomocą ostrych nożyczek należy przeciąć rdzeń kręgowy u podstawy czaszki.
Następnie usuń skórę z górnej części czaszki. Przetnij czaszkę bocznie pomiędzy kością ciemieniową a kością międzyciemieniową, lub pomiędzy obszarem mózgowia a obszarem kory. Po tym etapie przetnij czaszkę od podstawy do nosa wzdłuż szwu strzałkowego.
Na tym etapie ostrożnie usuń miękką kość ciemieniową, odsuwając każdą półkulę na bok. Następnie wprowadź szpatułkę do mózgu powyżej móżdżku, aby wydobyć korę. Umieść ją w lodowatym buforze GM i powtórz procedurę, aby zebrać kolejne fragmenty kory.
Następnie wypłucz korę w lodowatym buforze GM. Potem przenieś dwie próbki kory do homogenizatora szklanego z dnem zawierającego 5 mL zimnego buforu GM. Delikatnie zhomogenizuj korę, wykonując od 5 do 10 ruchów tłuczkiem A (luźnym), a następnie od 5 do 10 ruchów tłuczkiem B (ciasnym).
Liczba cykli zależy od konkretnego homogenizatora. Przenieś homogenizat do 15 mililitrowej probówki stożkowej. Odwiruj go przy 1000 ×g.
Wirować przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce Allegra six KR, aby odwirować resztki komórkowe i jądra. Nanieść 2 mL nadsączu na każdy gradient sacharozy Per, stosując jeden gradient dla każdej całej kory, a następnie zakręcić probówki. Następnie wirować je w rotorze kątowym przy 32 500 ×g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w wirówce Beckman J 2 21.
Po zakończeniu procesu, przy użyciu odpowiednich adapterów, gradient powinien wykazać wyraźny prążek SN; należy odpipetować i odrzucić roztwór znajdujący się powyżej prążka SN. Używając szklanej pipety pasteurowskiej, odpipetowujemy prążek SN na interfejsie 15-23%; jeden gradient daje zazwyczaj około 0,9 do 1,1 ml SN. Następnie należy przenieść go do probówki stożkowej i przechowywać w lodzie.
Następnie dostosuj stężenie soli w SNS, dodając 1/10 objętości 10-krotnego buforu stymulacyjnego. Opcjonalnie dodaj 1000-krotny chlorek wapnia, aby uzyskać stężenie końcowe 12 nM. Następnie dodaj zapas TTX o stężeniu 1 mM, aby uzyskać stężenie końcowe 1 µM w celu zahamowania niespecyficznego pobudzenia.
Kolejnym krokiem jest wykorzystanie SNS w odpowiednim zastosowaniu analitycznym, takim jak badania translacji białek. W przypadku innych zastosowań lizat SN można oczyścić lub zagęścić, korzystając z zestawu do przygotowania próbek do elektroforezy SDS-PAGE firmy Pierce. Stężenie białka w SNS można określić za pomocą zestawu do mikroanalizy białek BCA.
Oto przykład sześciu prążków lub frakcji. Po homogenizacji kory mysiej i rozdzieleniu jej na nieciągłych gradientach sacharozy Perol, wzbogacone SNS znajdowały się w prążku piątym na granicy 23 do 15%; prążek ten został usunięty i poddany analizie za pomocą mikroskopii elektronowej. Przykład nienaruszonych pęcherzyków synaptycznych oraz zachowania elementów przedsynaptycznych i postsynaptycznych przedstawiono tutaj na western blocie.
Wykazano, że wzrost markerów synaptycznych i spadek zanieczyszczeń w frakcji SN z nieciągłego gradientu sacharozy potwierdzają, iż zwiększone wbudowanie S 35 metioniny po dodaniu glutaminianu wynika z syntezy białek de novo. Dodano 40 µM anemycyny, inhibitora syntezy białek. Rysunek ten przedstawia wyraźny spadek wbudowania S 35 metioniny w obecności anemycyny, z dodatkiem lub bez dodatku glutaminianu, w porównaniu do poziomów podstawowych.
W związku z tym, nieciągłe gradienty sacharozy Percoll pozwalają na szybkie otrzymanie wysoce aktywnego i względnie czystego SNS, który może być wykorzystany do badania translacji białek. Rysunek ten pokazuje, że frakcja piąta z nieciągłego gradientu sacharozy Percoll zawiera najwyższy poziom syntezy białek de novo. SNS otrzymany poprzez przepuszczanie homogenizatu kory przez serię filtrów o malejącej wielkości porów, a następnie wirowanie w nieciągłym gradiencie sacharozy Percoll w celu porównania, zawiera więcej uszkodzonych błon i mniej całych SNS niż SNS przygotowany metodą nieciągłego gradientu sacharozy Percoll. Wykazano, że SNS przygotowany metodą nieciągłego gradientu sacharozy Percoll wykazuje większą aktywność syntezy białek de novo niż SNS przygotowany metodą filtracji.
Wykazano, że SNS przygotowane z młodszych myszy wykazują większą aktywność translacyjną niż SNS z myszy starszych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak izolować translacyjnie aktywne strefy neurosynaptyczne poprzez homogenizację kory mózgu myszy, wirowanie homogenatu w rotorze z koszyczkami wahadłowymi, wirowanie nadsączu w gradiencie sacharozy w rotorze stałokątowym, a następnie pobranie powstałego prążka strefy neurosynaptycznej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę przygotowania translacyjnie aktywnych synaptoneurosomów (SNs) z kory mózgu myszy z wykorzystaniem nieciągłego gradientu gęstości Percoll-sukroza. Technika ta pozwala na szybkie przygotowanie preparatu przy jednoczesnym zminimalizowaniu uszkodzeń mechanicznych i toksyczności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biochemia
Wstęp
- Synaptoneurosomy są niezbędne do badania funkcji synaptycznych.
- Tradycyjne metody mogą powodować uszkodzenia mechaniczne próbek.
- Gradienty gęstości mogą zmniejszyć toksyczność dla komórek.
- Zrozumienie aktywności translacyjnej w synapsach jest kluczowe dla badań z zakresu neuronauki.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody izolacji aktywnych synaptoneurosomów.
- Poprawa jakości preparatów synaptosomalnych na potrzeby badań.
- Umożliwienie dalszych badań nad funkcjami i mechanizmami synaptycznymi.
Zastosowane metody
- Homogenizacja kory mózgu myszy.
- Wirowanie homogenatu w celu rozdzielenia składników.
- Nałożenie supernatantu na gradienty Percoll-cukier.
- Końcowe wirowanie w celu zebrania frakcji synaptosomów.
Główne wyniki
- Analiza Western blot potwierdziła wzbogacenie frakcji o białka synaptyczne.
- Doświadczenia z wbudowywaniem metioniny S35 wykazały aktywność translacyjną.
- Metoda ta skutecznie ogranicza uszkodzenia mechaniczne w porównaniu z technikami tradycyjnymi.
- Niska toksyczność Percoll zwiększa żywotność komórek w preparatach.
Wnioski
- Opisana metoda jest skuteczna w przygotowywaniu aktywnych synaptoneurosomów.
- Stanowi ona niezawodne narzędzie do badania mechanizmów synaptycznych.
- W przyszłych badaniach technikę tę można wykorzystać w różnych zastosowaniach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Izolacja synaptoneurosomów umożliwia mechanistyczne ograniczenie ryzyka w przypadku celów synaptycznych poprzez zachowanie natywnych kompleksów białek presynaptycznych i postsynaptycznych. Metoda ta wspiera walidację celów w procesie odkrywania leków w neurobiologii, dostarczając translacyjnie aktywnych preparatów odzwierciedlających fizjologiczne gospodarowanie neuroprzekaźnikami. Podejście z wykorzystaniem gradientu Percoll-cukier redukuje artefakty wynikające z uszkodzeń mechanicznych i cytotoksyczności, zwiększając wiarygodność danych w kampaniach identyfikacji związków wiodących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na badanie hipotez terapeutycznych poprzez analizę mechanizmów pobierania, magazynowania i uwalniania pęcherzyków synaptycznych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez ocenę dynamiki neuroprzekaźników w uszczelnionych zakończeniach nerwowych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez ilościowe określanie syntezy białek de novo za pomocą wbudowywania S35 metioniny jako odczytu aktywności translacyjnej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych analiz mierzących translację białek synaptycznych lub wpływ leków na cykl pęcherzykowy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zstandaryzowane, powtarzalne wydajności SN (0,9–1,1 mL na korę) z minimalną zmiennością między partiami dzięki kontrolowanemu warstwowaniu gradientu.
- Gotowość do analizy: Zapewnia skalowalność dla platform do screeningu związków, które wymagają nienaruszonych zakończeń synaptycznych z zachowanymi markerami presynaptycznymi i postsynaptycznymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Pozwala na zachowanie istotnych dla choroby kompleksów białek synaptycznych na wszystkich etapach – od odkrycia po walidację przedkliniczną modulatorów celowanych w OUN.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Potwierdza mechanizm działania ukierunkowany na konkretny cel poprzez korelację wbudowyywania metioniny S35 stymulowanej glutaminianem z cyklem pęcherzyków synaptycznych.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o poziomy aktywności translacyjnej, które są wyższe w korze mysiej osobników młodocianych (P13–P21) i obniżone przez inhibitory syntezy białek, takie jak anisomycyna.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celu terapeutycznego po identyfikację wiodących związków, w którym funkcjonalne testy synaptyczne służą do priorytetyzacji związków przed badaniami nad skutecznością przedkliniczną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez izolację frakcji wzbogaconych w synapsy, zwalidowanych za pomocą western blot pod kątem markerów synaptycznych i zredukowanym profilem zanieczyszczeń.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy SN z danymi ilościowymi, takimi jak szybkość wbudowywania S35 metioniny, co umożliwia porównanie wpływu związków na syntezę białek.
- Analityka: Generuje pomiary aktywności translacyjnej, które pomagają zespołom porównywać funkcjonalne stany synaptyczne w różnych warunkach lub modelach genetycznych.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez zachowanie mechanizmów cyklu pęcherzyków synaptycznych istotnych dla dopasowania biomarkerów w wskazaniach neurodegeneracyjnych lub neuropsychiatrycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku platformę preparacji SN kory mózgu, którą można stosować w wielu projektach badających translację białek synaptycznych lub indukowaną lekiem modulację dynamiki pęcherzyków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w zakresie zaangażowania celu synaptycznego poprzez zachowanie zdolności do wychwytu, magazynowania i uwalniania neuroprzekaźników.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja za pomocą izotonicznych gradientów Percoll-sacharoza, które eliminują zastosowanie mediów cytotoksycznych i redukują liczbę etapów wirowania, co zwiększa powtarzalność.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje go/no-go dzięki kwantyfikacji aktywności translacyjnej jako funkcjonalnego odczytu synaptycznego, co zmniejsza ryzyko biologiczne w późnych etapach programów CNS.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja związków skorygowana o ryzyko na podstawie zależnych od dawki efektów w syntezie białek SN, co wspiera efektywność kapitałową w walidacji celu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w sekcjowaniu tkanek, technice homogenizacji oraz przygotowywaniu gradientu gęstości, aby uniknąć uszkodzenia kory i zapewnić wyraźne granice między warstwami.
- Metoda jest zależna od infrastruktury do wirowania (rotory z koszykami wahadłowymi i rotory stałokątne) oraz kontroli temperatury (4°C) przez cały czas przetwarzania w celu zachowania integralności SN.
- Konieczna jest standaryzacja liczby pociągnięć homogenizatora oraz objętości warstw gradientu pomiędzy zespołami, aby zminimalizować zmienność między użytkownikami w zakresie wydajności i aktywności SN.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują dostosowanie wieku myszy (P13–P21) do rozwojowych profili synaptycznych oraz optymalizację stężenia TTX (1 µM) w celu zahamowania nieswoistego pobudzenia neuronów w dalszych analizach.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność szybkiego przetwarzania próbek po sekcji, aby zapobiec utracie aktywności, oraz wymóg walidacji poprzez wbudowywanie S35 methionine lub western blot w celu potwierdzenia wzbogacenia synaptycznego.
