Monitorowanie zmian równowagi w strukturze RNA za pomocą „peroksydacyjnego” i „oksydacyjnego” mapowania śladów rodników hydroksylowych

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest ustalenie, w jaki sposób zwijają się cząsteczki RNA, przy użyciu metody footprintingu rodnikami hydroksylowymi. Cel ten osiąga się poprzez znakowanie końców, oczyszczanie żelowe i wstępne zwijanie RNA, co zapewnia integralność konformacyjną RNA przed następnym etapem, czyli zwijaniem indukowanym przez magnez; następnie miesza się odczynniki Fentona w celu wygenerowania rodników hydroksylowych, które mogą następnie przeciąć szkielet RNA zgodnie z jego dostępnością dla rozpuszczalnika. Następnie produkty cięcia RNA są rozdzielane za pomocą denaturującej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym i wizualizowane metodą autoradiografii.

Całki pasm są ilościowo określane za pomocą oprogramowania do półautomatycznej analizy footprintingu. Końcowym celem jest wygenerowanie izoterm fałdowania odzwierciedlających tworzenie struktury trzeciorzędowej RNA. Osiąga się to poprzez skalowanie znormalizowanych całek pasm do ułamkowego nasycenia.

Izotermy można następnie dopasować do równania Hilla. Główną zaletą mapowania śladów grup hydroksylowych jest uzyskanie informacji o strukturze trzeciorzędowej RNA przy użyciu niedrogich odczynników; ze względu na wyższą aktywność i niewielki rozmiar, rodniki hydroksylowe są idealnymi sondami do rozróżniania nukleotydów dostępnych dla rozpuszczalnika od nukleotydów zasłoniętych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii strukturalnej RNA.

Na przykład, w jaki sposób rybosomy wykorzystują jony metali do osiągnięcia swojej aktywnej konformacji? Odcisk radykalowy grupy hydroksylowej może być wykorzystany do zrozumienia podstaw specyficzności i rozpoznawania RNA. Oprócz ujawniania informacji o strukturze trzeciorzędowej RNA, metoda ta może służyć do wyznaczenia dokładnych miejsc wiązania białek w cząsteczkach RNA lub DNA.

Głównymi wyzwaniami tej metody są zapobieganie degradacji próbki przez rybonukleazę oraz optymalizacja stężenia żelaza w celu uzyskania odpowiedniego stopnia cięcia RNA. Ponadto szczegółowa analiza odstępów prążków może być dość skomplikowana. Główną korzyścią z tego filmu jest pomoc odbiorcy w zrozumieniu etapów planowania i pomyślnego przeprowadzenia eksperymentu footprintingu rodnikami hydroksylowymi. Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu należy przygotować wszystkie odczynniki do footprintingu zgodnie z opisem w protokole pisemnym.

Do filmu dołączono opis produkcji RNA z czterema powiązanymi DFO i znakowaniem końcowym. Oczyszczono radioaktywnie znakowane RNA za pomocą denaturującej elektroforezy żelowej. Oczyszczone RNA odzyskano poprzez dwie kolejne ekstrakcje z żelu przy użyciu 0,3 M octanu sodu.

Następnie wytrąć RNA, mieszając 0,5 mililitra roztworu wodnego z jednym mililitrem etanolu. Inkubować mieszaninę przez jedną minutę na suchym lodzie. Po odwirowaniu próbki odrzucić nadsącz. Przemyć osad RNA 70% etanolem.

Usunąć nadsącz po dodatkowym wirowaniu i wysuszyć osad w próżni. Następnie rozpuścić oczyszczone próbki RNA znakowane P 32. Do 330 mikrolitrów jednokrotnego buforu do reakcji odpipetować 30 mikrolitrów roztworu RNA do nowej probówki reakcyjnej.

Wytrąć RNA za pomocą etanolu, a następnie wysusz osad w próżni. Po wysuszeniu osad ten można wykorzystać do przygotowania drabinki referencyjnej zgodnie z opisaną procedurą pisemną. Pozostały buforowany roztwór RNA zdenaturowano, podgrzewając go w temperaturze 95 °C przez dwie minuty. Próbki chłodzono do temperatury pokojowej przez 15 minut, a następnie poddano krótkiemu wirowaniu, aby doprowadzić kondensat z powrotem do roztworu. Aby rozpocząć eksperyment footprintingu, przygotuj 27 probówek reakcyjnych, co zapewni wystarczającą liczbę próbek do wypełnienia żelu elektroforetycznego o 30 dołkach.

Po uwzględnieniu drabin oraz kontroli cięcia, należy określić końcowe stężenia jonów magnezu w taki sposób, aby były one równomiernie rozmieszczone w skali logarytmicznej w obrębie kilku rzędów wielkości wokół punktu środkowego miareczkowania; przygotowanie jonów magnezu w jednokrotnym buforze reakcyjnym opisano w tekście osobno. Inkubować RNA oraz roztwory jonów magnezu w temperaturze 50 °C przez pięć minut. Następnie zmieszać 10 µL roztworu RNA z 90 µL odpowiedniej ilości roztworu jonów magnezu.

Aby uzyskać objętość końcową 100 µL, inkubuj każdą mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 50 °C. Następnie pozwól roztworom wyrównać temperaturę do 25 °C przez jedną godzinę, aby umożliwić fałdowanie RNA. W międzyczasie, bezpośrednio przed rozpoczęciem reakcji footprintingu rodnikami hydroksylowymi, przygotuj mieszaninę reakcji kontrolnej zgodnie z opisem w protokole pisemnym.

Przygotuj reakcję peroksydacji, n nanosząc pipetą krople o objętości 2 µL każda: EDTA żelaza, askorbinianu sodu oraz nadtlenku wodoru na górną wewnętrzną ściankę probówki reakcyjnej zawierającej roztwór RNA, tak aby krople nie stykały się ze sobą. Rozpocznij reakcję footprintingu poprzez energiczne wymieszanie zawartości. Po 15 sekundach zatrzymaj reakcję, dodając 300 µL czystego zimnego etanolu.

Przelej probówki od trzech do pięciu razy. Na koniec wytrąć, przemyj i wysusz osad zgodnie z wcześniejszą procedurą. Jako alternatywę dla reakcji peroksydacyjnej, reakcję utleniającą z grupami hydroksylowymi przeprowadza się poprzez dodanie 5 µL świeżo przygotowanej mieszaniny do reakcji Fentona do próbek. Inkubuj reakcję utleniania przez 30 minut w temperaturze 25 °C.

Następnie dodaj 300 µL czystego zimnego etanolu, aby zatrzymać reakcję, i wymieszaj, obracając probówki. Ponownie przeprowadź precypitację. Po zakończeniu reakcji peroksydacyjnej lub oksydacyjnej przemyj i wysusz osad.

Rozpuścić wysuszone granulki RNA w ośmiu µL barwnika do ładowania żelu dwa. Potwierdzić resuspensję RNA znakowanego P 32 za pomocą licznika Geigera. Przygotować denaturujący 8% żel sekwencyjny z poliakrylamidu zgodnie ze standardowymi protokołami. Używając grzebienia 30-dołkowego, nałożyć próbki, w tym dwa wzorce oraz kontrolę z cięciem.

Rozdziel fragmenty RNA przy mocy od 60 do 75 watów przez dwie i pół godziny. Poddaj wysuszony żel działaniu ekranu fosforowego do przechowywania przez noc. Zeskanuj ekran fosforowy za pomocą systemu obrazowania do bezfilmowej autoradiografii.

Następnie przenieś plik z obrazem żelu do komputera w celu przeprowadzenia analizy. Aby rozpocząć analizę danych, uruchom program Safa oraz oprogramowanie open source służące do dopasowania pojedynczych prążków i ich kwantyfikacji. Wczytaj sekwencję RNA jako plik .TXT, a następnie obraz żelu jako plik .gel.

Zdefiniuj ścieżki i dostosuj intensywność prążków. Następnie wybierz ścieżkę kotwiczącą i przeprowadź wyrównanie żelu, przypisując prążki do nukleotydów w odniesieniu do drabinki trawienia RNA T1. Ilościowo określ intensywność prążków i użyj funkcji normalizacji/wykresu kolorystycznego, aby znormalizować dane i przypisać potencjalnie niezmienne reszty.

Zapisz wynik jako plik txt. SFA generuje arkusz kalkulacyjny zawierający kolumny odpowiadające ścieżkom na żelu oraz wiersze reprezentujące poszczególne całki pasm odpowiadające fragmentowi RNA. Najpierw należy zidentyfikować miejsca ochrony, w których występuje zauważalna zmiana dostępności rozpuszczalnika, porównując profil ochrony uzyskany z próbki bez jonów magnezu z profilem dla końcowego stężenia jonów magnezu.

Im niższa wartość, tym bardziej nukleotyd jest chroniony przed atakiem rodników hydroksylowych i odwrotnie. Następnie, w arkuszu kalkulacyjnym, należy stworzyć krzywe przejścia intensywności pasm poszczególnych nukleotydów lub ich grup w funkcji stężenia żelaza i magnezu; należy indywidualnie przeskalować te przejścia do funkcji nasycenia częściowego, zgodnie z opisem w części tekstowej niniejszego protokołu. W ostatnim kroku dane należy dopasować do równania Hilla.

Niniejsza analiza przelicza przejście na frakcję nasycenia, wyznacza punkt środkowy przejścia i stanowi fenomenologiczny test w celu sprawdzenia, czy wykazane przejście jest sigmoidalne. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki eksperymentów z mapowaniem w śladzie rodników hydroksylowych P four P six RRNA. Izotermy wyprowadzono z żeli sekwencyjnych przeanalizowanych przez program Safa, a następnie dopasowano zgodnie z opisem w sekcji analizy.

Obraz żelu wskazuje, że cięcie tła jest minimalne i że możliwe jest przypisanie pojedynczych nukleotydów dzięki wyraźnym prążkom w ścieżce T one. Fragmentacja RNA indukowana rodnikami hydroksylowymi znacznie przekracza poziom tła. Przejście z niskiego na wysokie stężenie jonów magnezu jest selektywnie powiązane ze spadkiem intensywności poszczególnych prążków oraz ich grup, co wskazuje na formowanie się RNA.

Ochrona struktury trzeciorzędowej odnosi się do pojedynczych nukleotydów lub grup sąsiadujących nukleotydów, których cięcie zmienia się równolegle; intensywności prążków są kwantyfikowane i normalizowane za pomocą analizy saffer. Wynikiem jest wykres termiczny wizualizujący stopień ochrony przed rodnikami hydroksylowymi. Przejście kolorystyczne opisuje zmianę dostępności po dodaniu magnezu i żelaza: przejście z bieli do czerwieni wskazuje na nukleotydy bardziej dostępne, natomiast przejście z bieli do niebieskiego wskazuje na nukleotydy bardziej chronione.

Każdy stopień zacienienia jest powiązany z wartością numeryczną, którą można nanieść na krzywą ochrony i przeanalizować za pomocą modelu wiązania, takiego jak równanie Hilla. W tym przykładzie stała dysocjacji równowagowej powiązana z ochroną 1 5 3 do 1 5 5 jest w przybliżeniu dwukrotnie większa od odpowiadającej jej wartości dla ochrony 1 6 3 do 1 6 4. Ten eksperyment z mapowaniem śladów rodników hydroksylowych może zostać przeprowadzony w półtora dnia, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o noszeniu rękawiczek i fartucha laboratoryjnego, aby uniknąć kontaminacji RNA. Ponadto końcowe stężenie żelaza zależy od systemu eksperymentalnego. Dlatego zalecamy przeprowadzenie eksperymentu z odpowiedzią na dawkę przed wykonaniem footprintingu zgodnie z niniejszą procedurą.

W celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania można zastosować inne metody, takie jak czasowo rozdzielone mapowanie (footprinting) rodnikami hydroksylowymi. Przykładowo, w którym krytycznym punkcie czasowym cząsteczki RNA osiągają błędnie sfałdowaną lub aktywną konformację po swoim powstaniu? Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny biologii strukturalnej do eksploracji trwałych, jak i przejściowych oddziaływań trzeciorzędowych kwasów nukleinowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób określania tworzenia się struktury trzeciorzędowej cząsteczek RNA. Należy pamiętać, że z uwagi na niebezpieczeństwo związane z etapem drugim, zaleca się zachowanie środków ostrożności, takich jak noszenie rękawic i okularów ochronnych, a także stosowanie osłony z pleksiglasu podczas wykonywania tej procedury.