Obrazowanie detekcji feromonów w preparacie cienkich przekrojów tkanki organu vomeronasalnego myszy

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie świeżych skrawków tkanki narządu nosowego RO lub VNO myszy w celu przeprowadzenia eksperymentów obrazowania wapnia w subpopulacjach i/lub pojedynczych neuronach w żywej tkance. Osiąga się to poprzez najpierw wyekstrahowanie VNO z nosa myszy, a następnie mikrodysekcję z torebki chrzęstnej pod mikroskopem stereoskopowym w zimnym A CSF. Następnie wyizolowany VNO jest ustawiany pionowo w bloku agarowym, a za pomocą mikrotomu wykonuje się świeże koronalne skrawki tkanki w celu weryfikacji integralności tkanki.

Kilka przekrojów poddano analizie pod mikroskopem konfokalnym po przeprowadzeniu immunohistochemii. Pozostałe przekroje obciążono barwnikiem wrażliwym na jony wapnia, a następnie przeprowadzono perfuzję domniemanymi ligandami feromonowymi, obserwując aktywację neuronów za pomocą obrazowania wapniowego. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów w dziedzinie węchu.

Na przykład w narządzie węchowym romo wykazuje się ekspresję setek receptorów feromonowych, lecz dla bardzo niewielu z nich zidentyfikowano ligandy. Receptory feromonowe są bardzo trudne do ekspresji w systemach heterologicznych. Konieczne było opracowanie wydajnego testu in vivo w celu przypisania konkretnych feromonów do odpowiednich receptorów.

Możemy wykorzystać myszy transgeniczne, w których specyficzna subpopulacja neuronów wykazuje ekspresję nieznanych receptorów i może być zidentyfikowana dzięki ekspresji GFP. Niniejszy test można również wykorzystać do farmakologicznego badania kanałów jonowych i enzymów uczestniczących w kaskadzie transdukcji Fairmont w celu zademonstrowania procedury. Dzisiaj pomogą nam Julian i Fabian, dwaj badacze z mojego laboratorium, przed rozpoczęciem sekcji.

Przygotuj świeży, zimny, sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy, A CSF nasycony oxy carb, łącząc wszystkie składniki z wyjątkiem chlorku wapnia. Nasyć roztwór poprzez bezpośrednie przedmuchiwanie go oxy carb. Następnie dodaj chlorek wapnia i uzupełnij objętość do pożądanej wartości za pomocą wody dwukrotnie destylowanej.

Przechowywać roztwór A CSF w lodzie do momentu użycia. Po uśmierceniu i dekapitacji dorosłej myszy przygotować szalkę Petriego z zimnym, stale natlenionym i nasyconym dwutlenkiem węgla roztworem A CSF. Po usunięciu żuchwy umieścić głowę myszy w szalce Petriego.

Ustaw głowę myszy pod mikroskopem stereoskopowym, aby zwizualizować podniebienie. Następnie wykonaj nacięcie poziome w górnej części podniebienia za pomocą mikronozyczek, a następnie usuń błonę podniebienia za pomocą mikropincety anatomicznej. Nawodnij i oczyść odsłoniętą jamę za pomocą A CSF.

Odetnij górną i dolną część przegrody nosowej. Następnie delikatnie wyciągnij przegrodę nosową zawierającą VNO i umieść ją pionowo bezpośrednio w czystym A CSF. Rozdziel dwie części VNO za pomocą pęsety mikrodisekcyjnej.

Zidentyfikuj chrząstkową torebkę VNO, a następnie delikatnie ją usuń, upewniając się, że wszystkie fragmenty chrząstki zostały usunięte. Tutaj wskazano wyizolowany VNO, fragmenty chrząstki oraz nieprzeprowadzony zabieg sekcji VNO; najpierw przygotuj 3% niskotopiący agar, a następnie przygotuj stanowisko pracy z niezbędnymi narzędziami. Wypełnij formę do zatapiania agarem i upewnij się, że temperatura jest niższa niż 41 °C przed zanurzeniem wypreparowanego VNO. Ustaw tkankę pionowo, aby uzyskać przekroje wieńcowe.

Umieść formę do zatapiania w lodzie na jedną minutę, aż agar stężeje. Po minucie wyjmij blok agaru, wytnij go w kształt parametaliczny, a następnie przyklej do uchwytu mikrotomu. Wykonaj koronalne przekroje VNO za pomocą mikrotomu z prędkością 0,5 millimeters per second, amplitudą 0,7 millimeters i grubością 100 micrometers w zimnym CSF.

Zbierz plasterki tkanki za pomocą pędzelka i umieść je w płytce do hodowli tkanek wypełnionej zimnym A CSF, aby zweryfikować integralność strukturalną zebranych plasterków tkanki; można je następnie utrwalić i poddać barwieniu immunohistochemicznemu w celu wykazania komponentów cytoszkieletu lub innych białek zainteresowania. W tym przypadku barwienie immunocytochemiczne przeciwko acetylowanej tubulinie w kolorze fioletowym wykazuje integralność strukturalną plasterka tkanki. Ponadto obserwacja specyficznej populacji neuronów, w których konkretny receptor feromonowy został oznakowany GFP, ukazuje zachowaną morfologię neuronalną; pracując w ciemni, można zaobserwować neurony z małymi, owalnymi ciałami komórkowymi i długimi dendrytami sięgającymi powierzchni światła, kończącymi się mikrokosmkami.

Inkubuj skrawki VNO w roztworze ładującym z zimnego A CSF z siedmioma mikromolarnymi URA 2:00 AM i 0,1%onic przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni celsius. Po godzinie przechowuj załadowane skrawki na lodzie w warunkach oxy carbonation aż do momentu użycia. Użyj pędzla, aby umieścić załadowane skrawki w komorze perfuzyjnej zawierającej A CSF, a następnie zabezpiecz skrawki za pomocą kotwicy do skrawków tkankowych.

Umieść komorę perfuzyjną na stoliku mikroskopu w układzie do obrazowania wapnia i prowadź ciągłą perfuzję utlenionym, nasyconym węglanami A CSF w temperaturze pokojowej. Obserwuj załadowane skrawki VNO, korzystając z długości fal fluorescencji odpowiadających barwnikowi, co w przypadku four O 2:00 AM wynosi od 340 do 380 nanometrów. Użyj odpowiedniego oprogramowania do rejestracji zmian stosunku wapnia wewnątrzkomórkowego. Do wywołania chemostymulacji niezbędny jest system perfuzyjny.

Przedstawiono tutaj przekrój wieńcowy tkanki vno myszy, w której subpopulacja neuronów wykazująca ekspresję receptora feromonu V1R2 wykazuje również ekspresję GFP, poddaną immunobarwieniu przeciwko acetylowanej tubulinie, zaznaczonej kolorem fioletowym. Powiększenia przekroju wykazują zachowanie integralności tkanki. Widoczne są neurony z długimi dendrytami sięgające powierzchni światła, a ekspresję białka strukturalnego można dostrzec w guzkach dendrytycznych i mikrokosmkach służących do obrazowania wapnia.

Przekroje tkanek załadowane FU są najpierw wizualizowane przy użyciu kontrastu fazowego Hoffmana w celu zlokalizowania pola zainteresowania, zaczynając od naczynia krwionośnego (pierwsza biała strzałka); obserwator powoli przesuwa się w stronę światła naczynia (druga biała strzałka) oraz obszaru neuroepitelialnego. Owalne ciało komórkowe neuronu nosowego RO. Trzecią białą strzałkę można zidentyfikować po długim i cienkim dendrycie.

Czwarta biała strzałka wskazuje do wnętrza światła, czyli neuronalny guzek dendrytyczny. Piąta biała strzałka wskazuje mikrokosmki w kontakcie z komórkami obciążonymi feromonami RA; tutaj pokazano, że są one następnie sekwencyjnie naświetlane przy 340 i 380 nanometrach, a ten stosunek długości fali fluorescencji odpowiada wewnątrzkomórkowym zmianom poziomu wapnia w wybranych neuronach, oznaczonych czarnymi, czerwonymi i niebieskimi okręgami. ATP jest wykorzystywane do określenia żywotności neuronów.

Należy zwrócić uwagę na zakres odpowiedzi wapniowych wykazanych przez trzy wybrane neurony oraz na fakt, że neuron numer dwa (zaznaczony czerwonym kółkiem) nie reaguje na TP, w związku z czym zostanie on wykluczony z dalszej analizy. Następnie przeprowadza się stymulację chemiczną przy użyciu moczu oraz mieszaniny feromonów mysich, badając głębsze warstwy skrawka tkanki. Można zlokalizować subpopulację neuronów wykazujących ekspresję zarówno GFP, jak i receptora V1RR2.

Tutaj przedstawiono neuron wykazujący ekspresję zarówno GFP, jak i receptora V1RB2, obok neuronu niewykazującego ekspresji V1RB2. Obie komórki zostały załadowane barwnikiem URA-2:00 AM, a neuron wykazujący ekspresję V1RB2 wykazuje skok poziomu wapnia w odpowiedzi na perfuzję liganda receptora, 2-hepnonu. Co ciekawe, neuron niewykazujący ekspresji V1RB2 również reaguje na 2-hepnon, co demonstruje złożoność kodowania feromonów w VNO.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wyizolować i mikrodysektować mózg myszy w celu przygotowania świeżych skrawków tkanki. Protokół ten można również dostosować do badań fizjologicznych z wykorzystaniem alternatywnych barwników wapniowych i konfiguracji mikroskopowych. Powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.