Synteza peptoidów metodą submonomerową w fazie stałej oraz ich samoorganizacja w wysoko uporządkowane nanoarkusze

Ogólnym celem tej procedury jest opisanie prostej i wydajnej metody syntezy peptydów w fazie stałej oraz wodnego samoorganizowania się peptydów w wysoko uporządkowane nanoarkusze. Peptydy, strukturalnie podobne do polipeptydów, są polimerami podstawionej glicyny, w których łańcuchy boczne są przyłączone do azotu, a nie do węgla alfa. Proces rozpoczyna się od syntezy specyficznej sekwencji peptydowej metodą podmonomerową.

Metoda submonomerowa składa się z dwóch prostych etapów chemicznych, które wprowadzają każdy monomer do łańcucha sekwencyjnie. Najpierw aminę przyłączoną do nośnika stałego poddaje się bromoacetylacji. Następnie bromek zostaje zastąpiony aminą pierwszorzędową.

Kroki te są powtarzane do momentu uzyskania pożądanej długości łańcucha. Po wydłużeniu łańcucha peptyd jest odczepiany od nośnika stałego, a otrzymany surowy olej peptydowy jest oczyszczany za pomocą HPLC i charakteryzowany, aby zainicjować samoorganizację peptydów w nanoarkusze. W szklanej probówce przygotowuje się rozcieńczony wodny roztwór buforowy peptydu i delikatnie go miesza. Jako ostatni krok.

Nanoarkusze są badane pod mikroskopem. Wyniki wykazują, że iteracyjny cykl dwóch prostych etapów chemicznych może prowadzić do otrzymania polimeru o specyficznej sekwencji, który spontanicznie samoorganizuje się w nanoarkusze. Peptydy stanowią nową klasę polimerów bioinspirowanych, których właściwości plasują się pomiędzy właściwościami białek a tradycyjnych polimerów.

Są one wytrzymałe i wszechstronne syntetycznie, podobnie jak tradycyjne polimery, a jednocześnie wysoce konfigurowalne i specyficzne pod względem sekwencji, jak białka i DNA. Peptydy wyłaniają się jako zaawansowany materiał pozwalający rozwiązać kluczowe problemy w biomedycynie i inżynierii materiałowej, takie jak identyfikacja leków bioaktywnych czy projektowanie sztucznych białek. Główne zalety peptydów obejmują precyzyjną kontrolę sekwencji, dostępność niezwykle zróżnicowanych bloków budulcowych, wydajną syntezę oraz stabilność wobec proteaz. Opisano ogólną metodę manualnej syntezy peptydów z wykorzystaniem podstawowego sprzętu i komercyjnie dostępnych odczynników, co umożliwia łatwą syntezę peptydów w większości laboratoriów.

Wizualna demonstracja etapów syntezy jest kluczowa i stanowi cenny punkt odniesienia dla osób rozpoczynających pracę w dziedzinie syntezy na fazie stałej. Po raz pierwszy opisano tutaj oczyszczanie i charakteryzację amfipatycznego peptydu o długości 36 merów, a także jego samoorganizację w wysoko uporządkowane nanoarkusze. Rozpocznij ten protokół od przygotowania aparatury doświadczalnej zgodnie z opisem w protokole pisemnym.

W celu zapewnienia przejrzystości poniższe kroki zostaną wykonane w szklanym naczyniu reakcyjnym zamiast w jednorazowym polipropylenowym wkładzie z fritą. Po umieszczeniu 100 mg żywicy R-amid w naczyniu reakcyjnym z fritą, należy napęcznieć żywicę, dodając dwa mililitry dimetyluformamidu lub DMF, a następnie mieszać poprzez przepuszczanie pęcherzyków gazu przez 10 minut. Następnie należy odessać roztwór za pomocą próżni, aby wyizolować napęczniałą żywicę.

Następnie dodaj jeden mililitr 20% pełnej metylopirydyny w DMF, aby usunąć grupę ochronną FM O. Mieszaj przez dwie minuty, a następnie zlej płyn. Powtarzaj ten proces przez 12 minut, po czym przepłucz żywicę, dodając dwa mililitry DMF, mieszając przez 15 sekund i zlewając płyn.

Rozpocznij wzrost łańcucha peptydowego od pierwszego cyklu submonomeru, który obejmuje etap bromoacetylacji oraz etap wypierania. W celu przeprowadzenia bromoacetylacji dodaj jeden mililitr 0,6 M kwasu bromooctowego w DMF oraz 86 µL diizopropylokarbodiimidu. Po wytrząsaniu przez 30 minut odlej zawartość i przemyj dno dwoma mililitrami DMF.

Następnie przeprowadź proces przemieszczenia, dodając 1 ml aminy o stężeniu od 1 do 2 M w N-metylo-2-pyrolidonie i inkubując przez 30 do 120 minut; po inkubacji odlej ciecz i wypłucz 2 ml DMF. Kontynuuj wydłużanie łańcucha peptydowego poprzez powtarzanie cyklu submonomeru. Po wykonaniu ostatniego przemieszczenia wypłucz 2 ml DMF.

Następnie nałóż zakrętkę do płukania metanem diora i przechowuj naczynie reakcyjne do momentu odszczepienia. Aby rozpocząć proces odszczepiania, przenieś całą wysuszoną żywicę do 20 mililitrowej szklanej fiolki scyntylacyjnej; pracując w dygestorium i stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, dodaj do fiolki scyntylacyjnej cztery mililitry kwasu trifluorooctowego lub koktajlu do odszczepiania TFA i zakręć. Mieszać intensywnie od 10 minut do dwóch godzin w temperaturze pokojowej.

Alternatywnie można użyć wytrząsarki rotacyjnej do wymieszania roztworu. Roztwór z etapu odszczepiania TFA należy zebrać, filtrując żywicę przez jednorazowy polipropylenowy wkład z fritym do nowej, wcześniej zważonej 20 mililitrowej szklanej fiolki scyntylacyjnej. Następnie należy dodać jeden mililitr świeżego koktajlu do odszczepiania, aby wypłukać żywicę i zebrać pozostały peptyd.

Powtórz tę czynność, płucząc dwukrotnie. Odparuj TFA, kierując delikatny strumień azotu lub używając ewaporatora Biot Charge V 10. Rozpuść otrzymany surowy olej w sześciu mililitrach roztworu acetonitrylu i wody w stosunku 1:1.

Następnie zamrozić i liofilizować próbkę. Proces ten należy powtórzyć raz jeszcze po drugiej liofilizacji. Odnotować masę produktu surowego i przechowywać go w postaci suchego proszku w temperaturze -20 °C, analizując za pomocą analitycznego HPLC w fazie odwróconej oraz/lub LCMS z jonizacją elektrospray.

Czystość surowego produktu oraz obecność pożądanej masy cząsteczkowej można określić, postępując zgodnie z procedurami opisanymi w tekście. Surową mieszaninę peptydów można następnie oczyścić za pomocą preparatywnej HPLC w fazie odwróconej zgodnie z opisaną procedurą. Niniejsza sekcja opisuje protokół tworzenia arkuszy z amfifilnego peptydu o długości 36 reszt, o specyficznej sekwencji jednowaściegowej.

Po syntezie, oczyszczeniu i liofilizacji nici peptydowej, otrzymany biały proszek rozpuszcza się w DMSO w celu przygotowania 2 mM roztworu zapasu. Następnie należy przygotować 20 µM roztwór peptydowy zgodnie z plikiem Dr.Glass. W pierwszej kolejności dodać 445 µL wody Milli-Q oraz 50 µL 10x buforu do formowania arkuszy.

Wymieszaj zawartość probówki za pomocą vortexa. Następnie dodaj 5 µL roztworu zapasu peptydu o stężeniu 2 mM i delikatnie wymieszaj. Powstałe arkusze roztworu formują się poprzez łagodne wytrząsanie rozcieńczonego wodnego roztworu peptydu.

Powolne przechylanie zakręconej szklanej fiolki z pozycji poziomej do pionowej. Powoduje to łagodne wstrząsanie arkuszami, co również prowadzi do ich powstania. Jednakże w przypadku wielu wysokiej jakości arkuszy mają one tendencję do bycia mniejszymi i posiadania mniejszej liczby prostych krawędzi.

Powoli obracaj szklane fiolki wokół osi poziomej przez jeden dzień, używając rotatora do probówek lub dostosowanej kołysarki, w celu barwienia nanoarkuszy fluorescencyjnie; dodaj 1 µL Nile red o stężeniu 100 µM do 100 µL roztworu nanoarkuszy, aby uzyskać końcowe stężenie 1 µM Nile red. Nile red jest barwnikiem wrażliwym na środowisko, którego intensywność fluorescencji wzrasta po zlokalizowaniu w środowisku hydrofobowym. Następnie przygotuj 1% roztwór agarozy w gorącej wodzie i wlej go do plastikowej szalki Petriego.

Upewnij się, że roztwór aros ma grubość około 1/8 cala i pozwól roztworowi ostygnąć bez zakłóceń na płaskiej powierzchni. Po zastygnięciu aros użyj szpatułki, aby wyciąć kwadraty o wymiarach 1 cm na 1 cm. Następnie przenieś wycięte kwadraty na szkiełko przedmiotowe, aby zgromadzić arkusze w tej samej płaszczyźnie; nanieś 1 µL roztworu arkusza na kawałek aros.

Po dwóch minutach aros powinien wchłonąć bufor, pozostawiając arkusze na powierzchni. Obrazowanie arkusza należy przeprowadzić w ciągu 15 minut. Alternatywnie, aby obrazować arkusze i roztwór, należy nanieść 15 µL do uszczelki o średnicy 20 mm i grubości 0,12 mm na szkiełku przedmiotowym.

Przykryj próbkę szkiełkiem nakrywką i wykonaj obrazowanie w ciągu kilku dni, aby przeprowadzić SEM nanoruwek. Najpierw poddaj płytki krzemowe trawieniu plazmowemu, aby wspomóc adsorpcję nanoruwek. Następnie nanieś 20 µL roztworu nanoruwek peptydowych na podłoże krzemowe potraktowane plazmą i pozostaw roztwór na trzy minuty; usuń nadmiar roztworu końcówką chusteczki Kimwipe, nanieś 20 µL wody na powierzchnię i ponownie odsącz nadmiar roztworu, aby usunąć bufor i sole.

Alternatywnie, roztwory arkuszy peptydowych poddaje się dializie przeciwko wodzie w celu usunięcia buforu i soli. W takim przypadku 20 µL zdializowanego roztworu arkusza można nanieść na podłoża krzemowe potraktowane plazmą i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu roztworu arkusza na podłożach krzemowych potraktowanych plazmą, arkusz można obrazować za pomocą SEM, wykorzystując detektor wewnątrzsoczewkowy (in lens) przy energiach wiązki od 1 kV do 5 kV.

Przeprowadzono syntezę, charakterystykę i oczyszczanie sekwencyjnego 36 me peptydu blokowo-naładowanego, który składa się w wysoce uporządkowaną dwuwymiarową nanoarkusz. Aminy wykorzystane do syntezy 36 me peptydu blokowo-naładowanego to etylenodiamina, fenetyloamina oraz t-butyl beta-alanina. Po syntezie surowy peptyd oddzielono od żywicy za pomocą 95% wodnego TFA.

Po zebraniu i odparowaniu roztworu TFA, surowy peptyd blokowy 36 me poddano oczyszczaniu za pomocą HPLC w fazie odwróconej. Masę oczyszczonego peptydu blokowego potwierdzono następnie za pomocą spektrometrii mas.

Obserwowana masa 4981,2 jest zbliżona do masy obliczonej wynoszącej 4981,74. Liofilizowany proszek rozpuszczono w DMSO w celu przygotowania 2 mM roztworu zapasu, który przechowywano w temperaturze 4 °C. Arkusze przygotowano zgodnie z wyżej wspomnianym protokołem i zobrazowano za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii optycznej.

Obserwowano różnorodne kształty o rozmiarach cech sięgających do 300 mikronów, przy czym szczególnie widoczne były proste krawędzie. Do obrazowania arkuszy wykorzystano również SEM, co w podobny sposób ujawniło wyraźne proste krawędzie. Niniejszy film opisuje prosty i wydajny protokół syntezy peptydów na podłożu stałym oraz wodną samoorganizację peptydów w nanosheets.

Ponieważ dostępne są setki bloków budulcowych o średniej długości am, które można wykorzystać w tym protokole, przestrzeń projektowa dostępna dla polipeptydów jest praktycznie nieograniczona. Peptydy stanowią obiecujące materiały w badaniach z zakresu biomedycyny i nanonauki ze względu na swoją syntetyczną elastyczność, odporność oraz uporządkowanie. W szczególności na poziomie atomowym nanoarkusze mogą służyć jako potencjalna platforma dla dwuwymiarowych rusztowań ekspozycyjnych, mimetyków błon, biosensorów, mimetyków białek oraz do wytwarzania urządzeń.

Praca z odczynnikami żrącymi, takimi jak trior, kwas octowy i kwas bromooctowy, jest niezwykle niebezpieczna; aby zapobiec obrażeniom, wszystkie reakcje należy przeprowadzać w dygestorium, stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej.