Wysokoprzepustowa krystalizacja białek błonowych z wykorzystaniem metody lipidowych biceli

W niniejszym filmie zaprezentowana zostanie metoda przygotowania wysokoprzepustowych prób krystalizacji oczyszczonych białek błonowych z wykorzystaniem liposomów (tzw. Lipic B cells). W pierwszej kolejności przygotowuje się Lipic B cells poprzez mieszanie lipidów z detergentem, następnie do mieszaniny wprowadza się oczyszczone białko błonowe, a próby krystalizacji przeprowadza się przy użyciu robota nanolitrowego. Wizualna inspekcja z wykorzystaniem standardowego mikroskopu świetlnego pozwala na wykrycie obecności kryształów.

Po ich utworzeniu kryształy białek można wyekstrahować i zamrozić w celu przeprowadzenia pomiarów i wyznaczenia struktury. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że dzięki unikalnemu zachowaniu fazowemu komórek B, do krystalizacji można wykorzystać standardowy sprzęt i robotykę dostępną w laboratorium. Konfiguracja komórek B jest prostą techniką, która pozwala przenieść docelowe białko błonowe z detergentowego środowiska komórkowego do ośrodka lipidowego.

Daje to całkowicie nowy zestaw warunków do przesiewu. Jest to tak prosta metoda, która została z sukcesem zastosowana w przypadku wielu białek błonowych, że nie ma żadnego powodu, aby jej nie wypróbować. Pierwszym krokiem w krystalizacji opartej na limfocytach B jest przygotowanie lipidowej mieszaniny amfipatycznej formującej limfocyty B.

Proces ten wymaga znacznego nakładu pracy i jest najbardziej czasochłonny. Należy pamiętać, że jego ukończenie może zająć kilka godzin. Komórki B mogą formować się w różnych kombinacjach lipidów amfifilowych i w szerokim zakresie stężeń.

Sugerowane wartości początkowe znajdują się w tabeli 1 w towarzyszącym protokole pisemnym. Należy rozpocząć od przygotowania 1,0 ml mieszaniny DMPC i Chapo o stężeniu 35% w stosunku molarnym 2,8:1. W tym celu należy odważyć 0,26 g DMPC oraz 0,09 g Chapo do probówki. Doprowadzić objętość do 1,0 ml, używając wody dejonizowanej, a następnie wymieszać mieszaninę w wstrząsaczu typu vortex.

Następnie ogrzewaj mieszaninę w kąpieli wodnej do około 40 °C, aż uzyska ona konsystencję żelu. Umieść probówkę na lodzie. Próbka powinna ponownie stać się płynna.

Następnie ponownie mieszaj w wortexie przez kilka minut, kontynuując cykle ogrzewania, chłodzenia i wortexowania, aż lipidy zostaną całkowicie rozpuszczone. Należy pamiętać, że w miarę powtarzania cykli, po zakończeniu chłodzenia mieszanina może stać się mętna. W temperaturze pokojowej lub wyższej mieszanina będzie miała postać przejrzystego żelu, a na lodzie będzie gęstą cieczą. Komórki można przechowywać w temperaturze -20 °C w celu długoterminowego przechowywania.

Następnie oczyszczone białka są wprowadzane do medium komórek B. Jest to prosty proces, który należy przeprowadzić w tym samym dniu co krystalizację, co zostanie omówione w następnej sekcji filmu. Rozmrozić mieszaninę komórek B z DMPC w temperaturze pokojowej, aż do momentu zmiany fazy w przejrzysty żel.

Umieść mieszaninę na lodzie, aby ją upłynnić, a następnie krótko wymieszaj w wirówce typu vortex, aby przywrócić jednorodną fazę komórek B. Od tego momentu przechowuj mieszaninę komórek B oraz oczyszczone białko na lodzie. Pozwoli to utrzymać komórki B w fazie ciekłej, co umożliwi ich pipetowanie.

Następnie dodaj mieszaninę komórek B do oczyszczonego białka rozpuszczonego w detergencie w stosunku objętościowym jeden do czterech. Następnie delikatnie pipetuj roztwór w górę i w dół, aż stanie się on klarowny i jednorodny. Jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza, krótko odwiruj je w wirówce stołowej.

Inkubuj mieszaninę na lodzie przez co najmniej 30 minut, aby wspomóc pełną inkorporację białka do komórek. Mieszanina białka z komórkami jest teraz gotowa do prób krystalizacji. Próby krystalizacji zostaną zademonstrowane przy użyciu robota do krystalizacji mosquito.

Schłodzić płytkę 96-dołkową z wypukłym dnem (V bottom), umieszczając ją na lodzie. Przenieść mieszaninę białka i komórek pipetą do płytki, aby zapewnić minimalną lepkość roztworu. Przechowywać mieszaninę białka i komórek na lodzie do ostatniego kroku.

Wykorzystany tutaj robot posiada pięć platform. Na platformie trzeciej należy umieścić mikropłytkę z rezerwuarem, a na platformie piątej pokrywę krystalizacyjną, na którą będą naniesione krople. Następnie na platformie czwartej, najbliżej pozycji dozowania, należy umieścić płytkę z białkiem otrzymanym z komórek.

Zapewnia to, że mieszanina białka z komórkami zostanie pobrana przez robota jako ostatnia i natychmiast podana. Po uruchomieniu procesu za pomocą oprogramowania robot pobierze roztwór z rezerwuaru, a następnie mieszaninę białka z komórkami i naniosie je w formie kropel na pokrywkę, aby zapobiec nagrzewaniu i zwiększeniu lepkości podczas dozowania. Nie należy programować urządzenia Mosquito tak, aby mieszało roztwór z rezerwuaru z mieszaniną białka z komórkami bezpośrednio po zakończeniu cyklu.

Wyjmij płytkę z białkiem komórkowym z urządzenia i umieść ją na lodzie. Zdejmij pokrywę z urządzenia i połóż ją na płytce zawierającej roztwór w rezerwuarze w taki sposób, aby krople były odwrócone do góry nogami. Inkubuj płytkę w temperaturze 20 °C.

Należy zauważyć, że w celu formowania i optymalizacji kryształów można przetestować również inne temperatury. Wyższe temperatury indukują fazę lamelarną, która ma tę zaletę, że pozwala na wstępną organizację białka w warstwy. Można przeprowadzić przesiew temperatury od 4 °C do 20 °C.

Temperatury poniżej 4°C mogą spowodować wytrącanie się lipidów w dłuższym okresie czasu; pierwszego, trzeciego dnia oraz w kolejnych tygodniach należy oceniać wygląd i wzrost kryształów przy użyciu standardowego mikroskopu świetlnego. Przedstawiono tutaj obraz w polu jasnym oraz obraz UV igłowatych kryształów zaobserwowanych wyłącznie w warunkach ataku. W kryształach nie wykryto fluorescencji, co wskazuje na wynik fałszywie dodatni na tym obrazie.

Kryształ w kształcie pręta, który powstał przy zastosowaniu metylopropanodiolu jako czynnika wytrącającego. Kryształ wykazuje słabą fluorescencję, co sugerowało, że może to być kryształ białka, jednak analiza dyfrakcyjna rentgenowska wykazała, że nie jest on białkowy. Przedstawiono tutaj kryształ zaobserwowany około czterech tygodni po rozpoczęciu prób.

Silna fluorescencja pod światłem UV potwierdza, że jest to kryształ białka, co można było zaobserwować na tym filmie. Po uzyskaniu komórek B można je zmieszać bezpośrednio z oczyszczonym białkiem, a od tego momentu krystalizacja przebiega niemal dokładnie tak samo, jak w standardowych protokołach opartych na detergentach.

Kolejną wyraźną zaletą jest możliwość domieszkowania komórek B specyficznymi lipidami w celu optymalizacji. Technika ta charakteryzuje się ogromną wszechstronnością i jest na tyle prosta w zastosowaniu, że powinna być wypróbowana w każdym projekcie krystalizacji białek błonowych.