Krystalizacja białek błonowych do wyznaczania struktury z wykorzystaniem mezofaz lipidowych

Witajcie w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Membran. Nazywam się Martin Caffery. Przedmiotem naszych badań jest błona biologiczna, której schemat przedstawiono na pierwszym slajdzie; błona otaczająca komórkę oraz obecne w niej organella podkomórkowe jest strukturą cienką w skali molekularnej, o grubości zaledwie dwóch cząsteczek lipidów, w którą wbudowane są białka.

Interesujemy się strukturą i funkcjami stosowanymi zarówno w odniesieniu do lipidów, jak i białek. Jednakże, w ramach tej serii JO, ograniczę skupienie uwagi do białek błonowych. Dążymy do zrozumienia, w jaki sposób białka błonowe funkcjonują na poziomie molekularnym, z dwóch powodów.

Po pierwsze, istnieje satysfakcja intelektualna z wiedzy o tym, jak coś działa. Po drugie, znając zasadę działania – podobnie jak w przypadku roweru czy samochodu – pojawia się możliwość naprawy w razie awarii. Projektowanie leków jest oczywistym rezultatem tego rodzaju pracy.

Podejście, które przyjmujemy w celu zrozumienia mechanizmu działania białka błonowego na poziomie molekularnym, polega na wyznaczeniu jego struktury krystalograficznej. Wiąże się to z ustaleniem położenia w przestrzeni trójwymiarowej wszystkich atomów, lub przynajmniej wszystkich atomów poza wodorem, które tworzą białko. Metoda, której używamy w tym celu, nazywa się krystalografią rentgenowską makrocząsteczek, w skrócie MX.

Tutaj widzimy przykład białka błonowego, którego struktura została określona za pomocą MX; do przeprowadzenia mx wymagany jest kryształ białka o określonej jakości. Jak można sobie wyobrazić, proces określania struktury z wykorzystaniem krystalografii makromolekularnej składa się z wielu etapów, co zostało tutaj zilustrowane. Zazwyczaj obejmują one identyfikację białka błonowego jako celu, a następnie jego produkcję, oczyszczanie i krystalizację.

Pomiary dyfrakcyjne kryształu wykonuje się przy użyciu laboratoryjnego źródła promieniowania rentgenowskiego lub synchrotronu. Dane dyfrakcyjne są przetwarzane w celu uzyskania mapy gęstości elektronowej, do której następnie dopasowuje się model molekularny. Po udoskonaleniu model ten może służyć do badania mechanizmu działania białka oraz do projektowania leków w oparciu o strukturę.

Celem niniejszego artykułu JoVE jest pokazanie, w jaki sposób uzyskujemy kryształy białek błonowych o wysokiej jakości z wykorzystaniem mezofaz lipidowych, stosując tzw. metodę in meso. Niedawny przegląd tej metody oraz zakresu jej zastosowań znajduje się w pozycji pierwszej w bibliografii. Protokół krok po kroku, który będziemy tutaj realizować, opisano w pozycji drugiej, a schemat blokowy podsumowujący poszczególne etapy oraz czas wymagany do przygotowania próby krystalizacji białka błonowego metodą in meso przedstawiono tutaj.

Niniejszy materiał wideo obejmuje kroki ujęte w przerywane czerwone linie. Przedstawiono tutaj czynności niezbędne do przeprowadzenia krystalizacji w fazie mezo w trybie ręcznym. Obejmują one przygotowanie stężonego roztworu oczyszczonego białka membranowego z lipidem w celu utworzenia fazy mezo, zazwyczaj z dodatkiem monooleiny, aby lipid był bardziej widoczny.

W tym filmie wykorzystano roztwory precypitacyjne z czerwonym barwnikiem, urządzenia do pipetowania z wodą oczyszczoną, końcówki jednorazowe oraz zestaw szczelnych strzykawek Hamiltona, niektóre z nich z wymiennymi igłami, a także łącznik o wąskiej średnicy używany do mieszania roztworu białka z lipidami w celu przygotowania mease. Rozdzielacz wielokrotny firmy Hamilton, szkiełka przedmiotowe i nakrywkowe. Idealnie silikonizowaną, perforowaną, dwustronną taśmę dystansową do tworzenia studzienek, pęsetę, kruszony lód, chusteczki, kalkulator i co najważniejsze, dziennik laboratoryjny.

Poniższa procedura służy do przygotowania szklanej płytki krystalizacyjnej typu „sandwich”. W celu przygotowania, należy położyć zylaryzowany szkiełko mikroskopowe na blacie. Z jednej powierzchni paska perforacyjnej dwustronnej taśmy dystansowej należy usunąć papierową osłonę ochronną.

Przyklej taśmę lepką stroną do powierzchni szkiełka przedmiotowego, dociskając ją. Uszczelnij taśmę na szkiełku. Aby chronić dno dołków, między taśmą a brayerem lub wałkiem można umieścić folię aluminiową.

Oderwij drugą papierową osłonkę od taśmy, aby odsłonić jej górną lepką powierzchnię. Procedura ta pozwala uzyskać płytkę szklaną gotową do napełniania i późniejszego zapieczętowania; natychmiast po zakończeniu napełniania należy ją zapieczętować. Poszczególne zapięte szkiełka nakrywkowe należy umieścić w bliskim sąsiedztwie płytki, aby umożliwić szybkie i wydajne zapieczętowanie studzienek.

Umieść lipid w bloku z kontrolą temperatury w 45 °C przez trzy minuty, aby go stopić. Należy pamiętać, że stosowany lipid to zazwyczaj mono land. W tym filmie do lipidu dodano czerwony barwnik, aby umożliwić obserwację procesu topnienia.

Przygotować dwie szczelne strzykawki Hamiltona o pojemności 100 µL do użycia w etapie mieszania lipidów z białkiem. Ze strzykawki, która będzie zawierać roztwór białka, usunąć olej teflonowy. Obok niej umieścić strzykawkę, w której znajdą się lipidy. W tym przypadku olej pozostaje wewnątrz.

Umieść złączkę o wąskim prześwicie pomiędzy dwiema strzykawkami, a następnie połącz złączkę z końcem strzykawki z lipidami. Dokręć złączkę do strzykawki, ale nie rób tego zbyt mocno. Wyjmij tłok z cylindra strzykawki z lipidami.

Upewnij się, że lipid jest w stanie ciekłym. Ustaw pipetę na 30 µL i powoli pobierz 30 µL ciekłego lipidu z górnej warstwy. Fiolka z lipidem.

Lipid należy przechowywać w atmosferze azotu lub argonu w temperaturze -80 °C. Powoli wprowadź do otwartego końca strzykawki taką ilość stopionego lipidu, jaka się zmieści, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.

Wprowadź tłok do cylindra w taki sposób, aby stykał się z roztopionym lipidem, a następnie powoli przesuwaj tłok w górę cylindra, trzymając strzykawkę pionowo. Jak pokazano, przypadkowo uwięziony pęcherzyk powietrza unosi się w trakcie tego procesu i zostaje usunięty. W cylindrze znajduje się teraz korek z roztopionego lipidu, którego objętość należy dokładnie wyznaczyć.

Można to zrobić, odczytując oznaczenia na tulei strzykawki. W tym przypadku objętość wynosi 23 µL, co należy zapisać w dzienniku laboratoryjnym. Nasuń futro na igłę wystającą z łącznika.

Użyj tłoka, aby wypchnąć stopione lipidy w górę cylindra i powoli oraz ostrożnie wprowadzić je do igły znajdującej się w centrum sprzęgła. Jeśli igła zostanie lekko przepełniona, lipidy będą wypływać z jej otwartego końca. Przesuwając tłok nieco w tył, można wciągnąć nadmiar lipidów z powrotem do sprzęgła, aż znajdą się one na poziomie końcówki igły sprzęgła.

W tym przypadku zespół łącznika strzykawki jest w pełni załadowany i gotowy do połączenia ze strzykawką z białkiem. Roztwór należy wirować przy 14 000 G przez 10 min, a następnie od 5 do 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć duże agregaty. Przed przystąpieniem do prób krystalizacji należy wyjąć roztwór białka z wiaderka z lodem i doprowadzić go do temperatury pokojowej.

Oblicz objętość roztworu białka niezbędną do utworzenia fazy kubicznej przy pełnym lub zbliżonym do pełnego uwodnieniu dla oleanu w temperaturze 20 °C. Pełne uwodnienie wodą występuje przy zawartości wody bliskiej 40% wagowo, zgodnie z wykresem fazowym. Należy pamiętać, że strzykawka z lipidem została napełniona 23 µL mono o gęstości 0,94 mg/µL.

Odpowiada to 21,6 miligramom lipidów, zatem wymagane jest 21,6 razy cztery podzielone przez sześć, czyli 14,4 miligrama lub 14,4 mikrolitra roztworu białka. Za pomocą strzykawki Hamiltona o objętości 25 lub 50 mikrolitrów pobierz wymaganą objętość roztworu białka, przenieś roztwór na teflonową końcówkę tłoka w cylindrze strzykawki. Uważając, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza, ostrożnie wycofaj igłę i zmierz objętość roztworu białka w strzykawce. Powinna ona odpowiadać wartości wyznaczonej w poprzednim kroku.

W ramach przygotowania do połączenia z strzykawką wypełnioną lipidami, ostrożnie przesuń roztwór białka w górę cylindra, tak aby znalazł się na równi z jego otwartym końcem. Można to sprawdzić, patrząc przez koniec cylindra.

Roztwór białka lipiny oraz napełnione strzykawki są teraz gotowe do połączenia. Aby to zrobić, wkręć strzykawkę z białkiem w otwarty koniec łącznika przymocowanego do strzykawki z lipidami. Po połączeniu dwóch strzykawek za pomocą łącznika powinna powstać ciągła objętość cieczy, prowadząca od lipidów w jednej strzykawce, przez łącznik, aż do roztworu białka w drugiej strzykawce.

W ramach przygotowania do mieszania, zmontowany układ trzyma się obiema rękami, z jedną strzykawką w prawej i drugą w lewej dłoni. Moment obrotowy przykłada się do obu cylindrów poprzez sprzęgacz, używając palców i kciuków obu rąk, aby upewnić się, że uszczelnienie w rowkach sprzęgacza pozostaje nienaruszone podczas dokręcania. Uszkodzenie urządzenia do mieszania na tym etapie uszkodzi ALS i spowoduje wyciek; nadmierne dokręcanie również doprowadzi do wycieku.

Jest to kwestia doświadczenia, nieuchronnych prób i błędów oraz okazjonalnej utraty próbki. Dlatego warto poćwiczyć z lipidami i wodą lub roztworem buforowym, aby zapoznać się z działaniem układu przed użyciem cennego roztworu białka. Aby przeprowadzić mieszanie, należy przesunąć tłok po stronie białka w zmontowanym module mieszającym do jego ogranicznika kciukiem lub palcem wskazującym, wypychając roztwór białka z strzykawki z białkiem przez sprzęgacz do strzykawki z lipidami. Jeśli moduł został skutecznie uszczelniony, czynność ta spowoduje równy i przeciwny ruch tłoka po stronie lipidów.

Tłok po stronie lipidowej jest teraz wykorzystywany do przepompowania zawartości strzykawki z lipidami z powrotem przez chłodnicę do strzykawki z białkiem. Proces ten jest powtarzany wielokrotnie. Czasami wymaganych jest sto lub więcej przejść, aby uzyskać jednorodną fazę mieszaną.

Na początku mieszania ruch materiału w przód i w tył przez sprzęgacz może być nierównomierny i czasami wymagane jest użycie dodatkowej siły, aby doprowadzić do wymieszania. Jest to zjawisko oczekiwane. Pierwszemu etapowi mieszania zazwyczaj towarzyszy powstanie niejednorodnego zmętnienia w próbce, co również jest zjawiskiem oczekiwanym.

W miarę postępu homogenizacji tekstura, odczuwalna jako siła potrzebna do przesuwania tłoków w przód i w tył, staje się bardziej jednorodna i charakterystyczna dla lepkiej fazy kubicznej, podobnie jak wygląd wizualny powstającej fazy kubicznej. Jeśli warunki są odpowiednie i dojdzie do utworzenia fazy kubicznej, dyspersja w cylindrze strzykawki powinna stać się optycznie przejrzysta.

Zatem oznaczenia na korpusie strzykawki powinny być wyraźnie widoczne przez fazę mezo wewnątrz korpusu. W przypadku białek barwionych faza mezo będzie miała kolor białka, lecz pozostanie optycznie przezroczysta. Bardzo delikatne schłodzenie próbki podczas mieszania poprzez krótkotrwałe umieszczenie mieszadła strzykawkowego w lodzie może przyspieszyć homogenizację i uzyskanie przezroczystości.

Należy jednak pamiętać, aby nie mieszać próbki zbyt intensywnie; należy zachować ostrożność, by uniknąć gwałtownego mieszania, ponieważ może ono doprowadzić do wzrostu temperatury próbki na skutek ciepła tarcia. Na tym etapie uformowała się sześcienna faza mezofazowa, a białko zostało wbudowane w lipidową dwuwarstwę. Faza mezofazowa jest teraz gotowa do naniesienia do poszczególnych dołków płytek krystalizacyjnych.

Najpierw jednak fazę mezo należy przenieść do strzykawki Hamiltona o pojemności 10 µL zamontowanej na dozowniku powtarzalnym. Rozpocznij ten proces od połączenia strzykawki z dozownikiem. Napełnij strzykawkę fazą mezo o strukturze sześciennej.

Wyjmij igłę i tłok ze strzykawki. Pozostaw uszczelkę teflonową na miejscu. Odkręć nakrętkę mocującą z dozownika przy użyciu małej monety.

Przy całkowicie wycofanym ramieniu zapadki, włóż strzykawkę bez tłoka i igły przez pierścień mocujący dozownika. Nałóż uszczelkę węzła mocującego stroną uszczelki w stronę strzykawki i mocno przykręć ją do otwartego końca strzykawki.

Należy zadbać o to, aby strzykawka była odpowiednio wycentrowana w pierścieniu mocującym, a tłok znajdował się równolegle do ramienia zapadki. Oba te warunki można ocenić wizualnie. Wymagania te są istotne, ponieważ jeśli tłok nie będzie poruszał się swobodnie, podczas ładowania w strzykawce źródłowej wzrośnie ciśnienie, co może doprowadzić do wycieku. Przeciągnij tłok przez pierścień zaciskowy z nakrętką zaciskową odkręconą o kilka obrotów, a następnie wprowadź tłok do otwartego końca strzykawki.

Naciśnij całkowicie ramię zapadki, aby przesunąć tłok do wnętrza cylindra i sprawdź, czy porusza się on swobodnie i w pełni w cylindrze. Jeśli śruba i prowadnica zostały poluzowane, dokręć je ponownie i sprawdź ponownie, czy tłok porusza się swobodnie. Strzykawka dozująca jest teraz gotowa do napełnienia.

Przesuń tłok z jednej strony zmontowanego modułu mieszającego do kreski graduacji zero mikrolitrów. Aby przenieść fazę mezo do drugiej strzykawki i złączki, odłącz pustą strzykawkę z zamontowanym elementem UL z modułu mieszającego i niezwłocznie podłącz napełnioną strzykawkę z przymocowaną złączką do gwintowanego zakończenia strzykawki dozującej o objętości 10 mikrolitrów.

Kluczowe jest stopień szczelności wykonanego połączenia. Jak już wspomniano, napełniono strzykawkę dozującą, naciskając tłok strzykawki 100 µL w taki sposób, aby faza mezomorficzna przeszła przez sprzęgacz. Jeśli połączenie jest szczelne, a tłok w strzykawce dozującej porusza się swobodnie, to w miarę napełniania strzykawki dozującej tłok ten powinien zacząć przesuwać się w kierunku ruchu tłoka ładującego.

Odłącz strzykawkę ładującą z przymocowanym sprzęgiem od strzykawki dozującej. Do stalowego zakończenia strzykawki dozującej przymocuj krótką igłę o ściętym czubku i ostrożnie ją dokręć. Przymocuj tłok do ramienia zapadkowego, zaciskając węzeł w pierścieniu chwytnym.

Należy uważać, aby nie zawiązać węzła zbyt mocno, ponieważ może to spowodować zarysowanie i odkształcenie tłoka, czyniąc go niezdatnym do użytku. Ważne jest, aby zakres ruchu ramienia zapadkowego w stanie zaciśniętym był ograniczony do maksymalnie jednego cala.

Jak pokazano dalej, tłok może mieć tendencję do wyginania się, co może doprowadzić do niepowodzenia podawania. Kilkakrotnie naciśnij bęben zapadkowy, aby przesunąć tłok w cylindrze, wypełniając tym samym pustą przestrzeń igły i ładując ją. Krok ten należy powtórzyć do 10 razy, aż z końcówki igły zacznie wydostawać się ciągła nić fazy mesa.

Igła jest teraz gotowa do użycia w przygotowaniu prób krystalizacji, które należy rozpocząć niezwłocznie. Nie zaleca się przechowywania fazy sześcianowej z załadowanym białkiem przez zbyt długi czas przed przystąpieniem do prób krystalizacji. Ponieważ niektóre białka są niestabilne w fazie sześcianowej bez dodatku precypitantu, należy umieścić wielodołkową płytkę krystalizacyjną oraz szkiełko nakrywowe na powierzchni wyniesionej o kilka cali nad blat, aby ułatwić proces ładowania.

Optymalny kontrast i zwiększona widoczność są osiągane, gdy powierzchnia jest lekko ciemna. Zhomogenizować roztwory precypitantu i zdjąć zakrętki z fiolek. Ustawić dozownik precypitantu na 1 µL; trzymając strzykawkę dozującą pionowo w jednej ręce, drugą ręką ustawić końcówkę igły w centrum, bezpośrednio nad dnem dołka.

Krok pierwszy. Naciśnij przycisk w dozowniku powtarzalnym, aby wycisnąć bolusy molasy na powierzchnię szklaną. Objętość bolusa wynosi 200 nanolitrów.

Podczas korzystania ze standardowego dozownika wielokrotnego z strzykawką 10 µL, końcówka igły powinna znajdować się nie więcej niż kilkaset µm nad dnem dołka. Aby zapewnić prawidłowe i powtarzalne dozowanie, należy poświęcić chwilę na wprawę. Po napełnieniu czterech sąsiednich dołków medium mease, należy nanieść 1 µL roztworu precypitanta na wierzch każdego bolusa mease.

Używając końcówek jednorazowych o pojemności 2 µL na próbkę i działając jak najszybciej, należy umieścić szkiełko podstawowe dokładnie nad wypełnionymi dołkami, aby pokryły one powierzchnię równomiernie i zapewniły wodoszczelną izolację. Za pomocą szpatułki należy wywrzeć nacisk na szkiełko w miejscach jego styku z odsłoniętą lepką powierzchnią taśmy dystansowej. Proces dozowania odczynników i precypitatu można powtarzać do momentu wypełnienia i zamknięcia wszystkich dołków na płytce.

Płytka jest teraz gotowa do inspekcji oraz inkubacji. Oznacz płytkę w sposób czytelny w celu śledzenia próbek. Białka światłoczułe zazwyczaj obsługuje się poprzez owinięcie płytek folią aluminiową przed umieszczeniem ich w komorze inkubacyjnej.

Można je wyjąć i zbadać pod mikroskopem w przygaszonym lub odpowiednio kolorowym świetle. Płytki należy umieścić w komorze z kontrolowaną temperaturą, zazwyczaj w temperaturze około 20°C. W regularnych odstępach czasu należy sprawdzać obecność kryształów na ściankach, używając mikroskopu w świetle spolaryzowanym z powiększeniem 10- lub 20-krotnym.

Cel, harmonogram stosowany w laboratorium autora jest następujący: dzień 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 po ustawieniu. Dokładnie obejrzyj bolusy mease. Dostosuj głębię ostrości w obrębie próbki o grubości 140 micron.

Badanie należy przeprowadzić zarówno w świetle normalnym, jak i między skrzyżowanymi polaryzatorami; bezbarwne kryształy białek błonowych rosnące w fazie sześciennej w świetle normalnym wyglądają tak. Bezbarwne kryształy białek błonowych rosnące w fazie meso w świetle spolaryzowanym wyglądają tak lub tak, natomiast naturalnie kolorowe białka błonowe rosnące w fazie meso w świetle normalnym wyglądają tak lub tak.

Kolejnymi krokami w całym procesie wyznaczania struktury są zbieranie i schładzanie kryształów metodą krioletowania oraz rejestracja i przetwarzanie obrazów dyfrakcji rentgenowskiej z nich uzyskanych. Tematy te są omówione w oddzielnych artykułach JoVE z tej serii.