Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej małych białek błonowych do badań biologii strukturalnej metodą krystalografii elektronowej
29 października 2010
Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej (2D) w celu utworzenia uporządkowanych macierzy białek błonowych jest niezwykle istotnym i trudnym zadaniem w krystalografii elektronowej. Opisujemy tutaj nasze podejście do przesiewania i identyfikacji kryształów 2D, głównie małych białek błonowych o masie w zakresie 15 – 90kDa.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest zidentyfikowanie optymalnych warunków krystalizacji 2D w celu strukturalnego oznaczenia białek błonowych za pomocą krystalografii elektronowej. Osiąga się to najpierw poprzez zastosowanie kompatybilnego detergentu podczas oczyszczania, aby solubilizować białko z natywnej dwuwarstwy lipidowej. Drugim krokiem procedury jest dodanie egzogennych lipidów i usunięcie detergentu poprzez dializę mieszaniny białka, lipidów i detergentu, co prowadzi do powstania kryształów 2D w ściśle kontrolowanych warunkach.
Trzecim krokiem procedury jest gwałtowne zamrożenie próbek w celu uzyskania stanu szklistego. Ostatnim etapem procedury jest zebranie danych za pomocą cryo-EM. W efekcie, dzięki komputerowemu przetwarzaniu obrazów z uzyskanych danych, można wyznaczyć ostateczną strukturę białka.
Witajcie, reprezentuję laboratorium ze Szkoły Biologii na Georgia Institute of Technology. Nazywam się Tina dreaded.
Reprezentuję laboratorium Berry w szkole chemii i biochemii oraz laboratorium Schmidt Kray w szkole biologii w Georgia Institute of Technology. A ja jestem Matt Johnson z laboratorium Ingleborg Schmidt Cry w szkole biologii w Georgia Institute of Technology. Dzisiaj przedstawimy procedurę oceny prób koloryzacji 2D za pomocą em.
W naszym laboratorium stosujemy ten protokół w celu identyfikacji i optymalizacji warunków krystalizacji 2D. Przejdźmy zatem do realizacji. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować próbki barwione negatywnie na miedzianych siatkach do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) o gęstości 400 mesh, pokrytych warstwą węgla. Należy nanieść pipetą 2 µL próbki proteoliposomów pod pokrytą węglem siatkę TEM i inkubować przez 60 sekund.
Jeśli próbka nie rozłoży się równomiernie, należy ją delikatnie rozmazać bokiem końcówki pipety. Następnie krawędź należy zablokować odartym kawałkiem papieru filtracyjnego Watman nr 4. Zapewnia to optymalne usunięcie cieczy bez nadmiernego usuwania liposomów proteiny i pomaga zachować delikatną warstwę węglową.
Bezpośrednio po osuszaniu. Po 30 sekundach nanieś dwa mikrolitry 1% barwnika octanu uranylu, a następnie odsącz nadmiar od krawędzi siatki. Ponownie, jeśli próbka zawiera wysokie stężenia lepkiego glicerolu lub sacharozy, zazwyczaj w zakresie od 10 do 20%, pomocne może być przeprowadzenie kilku cykli płukania siatki buforem wolnym od glicerolu lub sacharozy przed barwieniem negatywowym, aby umożliwić prawidłowe barwienie roztworem octanu uranylu.
Po przygotowaniu siatek wykorzystuje się mikroskopię elektronową do wizualizacji próbki przy niskim powiększeniu, aby ocenić rozmieszczenie oraz morfologię błon, a także ogólną jakość siatki. Następnie stosuje się duże powiększenie w celu uzyskania obrazów i wykonania transformacji RIA tych obrazów w celu zidentyfikowania kryształów 2D. Aby rozpocząć analizę siatki w uchwycie próbek mikroskopu elektronowego i uzyskać wstępne wyobrażenie o średnim rozkładzie błon, należy zastosować średnie powiększenie od 2000 do 10 000 x.
Stopień rozmieszczenia membran, ich morfologię oraz rozmiar należy odnotować w dzienniku laboratoryjnym. Reprezentatywne obrazy należy zarejestrować za pomocą kamery CCD. Następnie, w razie potrzeby, próbki należy obserwować przy niskim powiększeniu, w zakresie od około 400 do 800 x, aby uzyskać ogólny obraz siatek.
Może to dostarczyć cennych informacji do oceny przygotowania siatki, ujawniając problemy z stężeniem próbki, nierównomiernym rozkładem protei i liposomów oraz częściowym przerwaniem filmu węglowego. Zidentyfikuj obszar siatki budzący zainteresowanie przy niskim lub średnim powiększeniu. Następnie użyj dużego powiększenia, aby ocenić możliwy uporządkowanie w różnych membranach.
Jest to kluczowe na wczesnych etapach prób krystalizacji 2D. Aby zidentyfikować obiecujące liposomy białkowe z obszarami dobrze uporządkowanymi oraz zweryfikować powtarzalność podczas późniejszych eksperymentów w celu określenia optymalnego ustawienia dużego powiększenia do przesiewania kryształów 2D, należy rozpocząć od powiększenia między 50,000 a 60,000 x. W zależności od wymiarów kryształu 2D i wielkości komórki elementarnej, ustawienie dużego powiększenia może zostać zmniejszone nawet do 30,000 lub zwiększone do 80,000.
Następnie, w obszarze przyległym do badanego fragmentu obrazu, ustawiamy defocus na około minus 400 nanometrów lub więcej, jeśli istnieje niepewność co do tego, czy badany obszar jest rzeczywiście błoną. Należy sprawdzić próbkę pod kątem obecności fragmentów folii węglowej, miką lub innych artefaktów, które mogłyby zostać pomylone z proteoliposomami. Należy również obserwować krawędzie, aby rozpoznać typowe fałdowanie i morfologię błon.
Następnie należy obejrzeć obszar zainteresowania za pomocą kamery CCD. Przy zbieraniu obrazu CCD przy optymalnym, wysokim powiększeniu, sieć mniejszego i/lub głównie hydrofobowego białka błonowego może nie być widoczna podczas wizualnej oceny samego obrazu CCD. W takim przypadku cały obraz jest wykorzystywany do obliczenia transformaty Fouriera (FT) w czasie rzeczywistym.
Jeśli jednak uporządkowana macierz jest mała, ta transformata Fouriera (FT) będzie zawierać znaczną ilość szumu. Aby poprawić stosunek sygnału do szumu, zmniejsz rozmiar zaznaczonego obszaru obrazu, przesuń zmniejszony obszar nad obrazem i wykonaj FT w czasie rzeczywistym, a następnie dostosuj funkcję gamma dla FT w czasie rzeczywistym w celu optymalnej identyfikacji uporządkowanych macierzy. Zbyt wysoka wartość gamma może przesłonić plamki z powodu wpływu szumu, podczas gdy zbyt niska wartość uniemożliwi zidentyfikowanie słabszych plamek. Przewidywana rozdzielczość kryształów 2D barwionych negatywnie powinna wynosić około 15 angstroms przy DFO wynoszącym minus 400 nanometers.
Należy spodziewać się zidentyfikowania od jednego do trzech rzędów plamek. Zwróć uwagę na ostrość plamek oraz występowanie mozaiki. Kryształy 2D małego białka błonowego o masie 18 kilodalton osiągają rozmiary do kilku mikronów.
Ostre i łatwo identyfikowalne przesunięcia plamek na FT wykazują, że sieć jest ciągła i pozbawiona mozaikowości. Sieć większego białka o bardziej rozległej domenie rozpuszczalnej można zidentyfikować na małym ekranie systemu zbierania obrazów T-E-M-C-C-D, jednak FT są niezbędne do lepszej oceny jakości sieci, w tym cech takich jak szum mozaikowy w FT nieuporządkowanego białka. Liposomy mogą zostać pomylone ze słabymi plamkami; należy ustalić, czy plamki wynikają z obecności małych dwuwymiarowych kryształów białka, czy z szumu.
Przesuń pudełko dla żywego ft. Jeśli plamki znikają natychmiast, są one szumem, ale jeśli pozostają niezmienione nawet na niewielkim obszarze, prawdopodobnie obecne są kryształy, ponieważ kryształy lipidów wykazują odrębną morfologię i ft. Kryształy lipidów można również rozpoznać poprzez wizualną inspekcję obrazu oraz spójne rozmiary komórek elementarnych.
W początkowych próbach może dojść do wytrącenia osadu. Inspekcja przy dużym powiększeniu służy do rozróżnienia wytrącania białek od agregatów lipidowych. W przypadku agregatów lipidowych rekonstytucja mogła w rzeczywistości nastąpić, a kolejne eksperymenty będą wymagały jedynie dostosowania parametrów niezbędnych do zwiększenia rozmiaru błon i uzyskania uporządkowania, a nie indukcji rekonstytucji przy 30 000 do 50 000 x.
Krawędzie tych ciemnych struktur ujawniają, że składają się one z membran pozbawionych białek. Próbki wytrącania w optymalnych warunkach będą zawierać wysoki odsetek kryształów 2D. Dążenie do uzyskania homogenicznego wyglądu membran nie jest konieczne, ponieważ do gromadzenia danych wybierane są wizualnie największe i najlepiej uporządkowane kryształy 2D.
Tego rodzaju próbki będą łatwo rozpoznawalne, gdy krystalizacja takich próbek zostanie wykorzystana do zbierania danych w krio-EM, aby uzyskać maksymalną liczbę obrazów o wysokiej rozdzielczości. W ramach tej procedury pokażemy, jak przeprowadzić przesiewanie 2D kryształów małych białek błonowych za pomocą TEM. Ważne jest, aby działać skrupulatnie i nie przeoczyć obiecujących warunków krystalizacji, ponieważ do tego momentu zainwestowali już Państwo znaczną ilość czasu i wysiłku.
To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca koncentruje się na optymalizacji warunków krystalizacji dwuwymiarowej (2D) białek błonowych, co jest niezbędne do przeprowadzenia krystalografii elektronowej. Zastosowane podejście obejmuje solubilizację białek, formowanie kryształów 2D oraz wykorzystanie kriomikroskopii elektronowej w celu określenia ich struktury.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biologia strukturalna
- Krystalografia elektronowa
Wstęp
- Białka błonowe są kluczowe dla wielu funkcji biologicznych.
- Określenie ich struktury jest trudne ze względu na ich złożoną naturę.
- Krystalizacja 2D jest metodą stosowaną do badania tych białek.
- Krystalografia elektronowa dostarcza strukturalnych danych o wysokiej rozdzielczości.
Cel badania
- Ustalenie optymalnych warunków 2D krystalizacji białek błonowych.
- Pogłębienie wiedzy na temat struktur białek błonowych.
- Ułatwienie wykorzystania krio-mikroskopii elektronowej w określaniu struktur.
Zastosowane metody
- Oczyszczanie białek przy użyciu kompatybilnych detergentów.
- Dodawanie egzogennych lipidów i usuwanie detergentów poprzez dializę.
- Tworzenie kryształów 2D w kontrolowanych warunkach.
- Szybkie mrożenie próbek do stanu szklistego w celu przeprowadzenia analizy.
Główne wyniki
- Skuteczne tworzenie kryształów 2D małych białek błonowych.
- Gromadzenie danych przy użyciu kriomikroskopii elektronowej.
- Obliczeniowe przetwarzanie obrazów dostarcza informacji strukturalnych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia architektury białek błonowych.
Wnioski
- Opisana metoda jest skuteczna w badaniu białek błonowych.
- Zoptymalizowane warunki krystalizacji usprawniają wyznaczanie struktury.
- Podejście to można zastosować do różnych małych białek błonowych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Rzetelna ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej małych białek błonowych ma kluczowe znaczenie dla rozwoju biologii strukturalnej we wczesnych etapach projektowania leków. Wysokorozdzielcza krystalografia elektronowa umożliwia precyzyjne poznanie struktury, co wspiera walidację celu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w przypadku białek błonowych będących celami terapeutycznymi. Ten schemat postępowania zwiększa pewność prognoz w kluczowych punktach zwrotnych w potokach badawczo-rozwojowych branży biofarmaceutycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację struktury białka błonowego w celu weryfikacji celu terapeutycznego.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie konformacji i montażu białka.
- Ułatwia identyfikację optymalnych warunków krystalizacji dla dalszych badań.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane protokoły przygotowania i przesiewania próbek proteoliposomów.
- Umożliwia powtarzalną, ilościową ocenę uporządkowania i morfologii kryształów za pomocą obrazowania EM.
- Umożliwia wybór dobrze uporządkowanych kryształów 2D do wysokorozdzielczego gromadzenia danych i przygotowania do analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje dane strukturalne z istotnymi dla choroby białkami błonowymi, jeśli jest to możliwe.
- Zapewnia ciągłość od wglądów strukturalnych na etapie odkrywania do opracowania modeli przedklinicznych.
- Zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późniejszym etapie poprzez wczesne potwierdzenie struktury i integralności celu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje proces odkrywania leków – od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego – stanowiąc podstawę dla projektowania leków w oparciu o strukturę oraz dalszych badań przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez ujawnianie architektury białek błonowych.
- Screening: Ustanawia powtarzalne kryteria jakości i uporządkowania kryształów, umożliwiając niezawodne przepływy pracy w kolejnych etapach.
- Analityka: Generuje ilościowe wyniki EM i transformaty Fouriera do analizy porównawczej warunków krystalizacji.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne etapy odkrywania z walidacją przedkliniczną poprzez potwierdzenie wierności strukturalnej celów molekularnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do oceny różnorodnych białek błonowych będących celami w różnych programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność w walidacji białek błonowych jako celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek, obrazowanie i analizę w celu skalowalnego wdrożenia.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji go/no-go i optymalizuje alokację zasobów poprzez priorytetyzację strukturalnie zwalidowanych celów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowanie ryzyka przy rozwoju i selekcji programów odkrywania leków celujących w białka błonowe.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii elektronowej oraz przygotowania próbek proteoliposomów.
- Wymaga dostępu do wysokorozdzielczego TEM, obrazowania CCD oraz narzędzi do analizy transformaty Fouriera w trybie online.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów przygotowania siatek i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowana do białek błonowych o różnych rozmiarach, choć mniejsze białka wymagają starannej identyfikacji.
- Potencjalne ograniczenia obejmują rozróżnianie rzeczywistego uporządkowania kryształów od szumu i artefaktów w obrazach EM.
